[发明专利]高密度蛭弧菌游泳体的发酵培养技术

说明书

技术领域

本发明属于发酵工程领域，具体是指一种可应用于减少、甚至完全消除有害菌的高密度蛭弧菌游泳体的发酵培养技术，不仅在水源性、食源性致病菌防治方面，而且在医学、环境污染、农业、工业、军事领域等方面将具有巨大的应用和发展前景。

背景技术

虽然采用生物防治的手段消除致病菌是当今世界工、农、医等各个领域的研究热点，但是目前消除致病菌的主要手段仍是各种物理和/或化学的方法，包括各种抗生素的使用。这些方法都存在着明显的弊端，首先，抗生素大量滥用，会导致一些副作用的产生，如病原菌的抗药性、抑制有益菌群等。其次，酸碱处理的方法虽可达到一定的灭菌/杀菌效果，但在有害菌形成生物膜后，这些方法的效果就相当的不理想。最后，物理的方法对各种致病菌的消除作用只能应用于相关领域的某一环节，而难以扩展到整个领域的所有环节。然而，生物防治的方法则可具有强大的优越性，极有可能使其服务于日常生活的病害防治以及生物战和恐怖袭击中大规模的水源性、食源性污染的处理等。

蛭弧菌能降解保护性细胞外聚合物并裂解宿主细胞的特性使其具有巨大的应用前景。首先，蛭弧菌的宿主范围广泛，对动物、日常生活等常见致病菌都有较强的清除作用，且对致病菌的裂解能力明显大于非致病菌，蛭弧菌制剂在清除致病菌的同时，对环境中的有益菌危害不大，而以有益菌作为宿主菌培养蛭弧菌的则例外；其次，蛭弧菌作为一种抗微生物因子几乎没有宿主抗性，能对致病菌发挥稳定持久的裂解作用，它能有效地预防自身基因组与其它细菌基因组之间发生基因重组和基因水平转移，并且也没有噬菌体所具有宿主过于专一的缺点；再次，蛭弧菌还可抵御自然界中某些有毒物质，其基因组可以编码多种有毒物质的抗阻蛋白，这预示蛭弧菌有可能成为新型抗生素或消毒剂。有研究表明，蛭弧菌不能存活于真核细胞内，由此揭示它对人体的危害极小；最后，蛭弧菌在没有宿主菌存在的环境中会因为“饥饿”而死，因此，使用蛭弧菌制剂不存在残留问题。

目前，中国200610039346.8号发明专利申请中提出了一种生产噬菌蛭弧菌制剂的方法，该方法所生产的蛭弧菌制剂的应用，虽然可解决目前用抗生素等方法导致的副作用问题，但其所生产的蛭弧菌制剂密度较低，导致使用量较大，成本较高，且是以有益菌作为宿主菌培养蛭弧菌、以蛭质体或/和游泳体混合物的形式作为终产品，存在着杂菌带入、作用滞后、潜在使用范围窄、对有益菌裂解能力过强等缺点。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种高密度蛭弧菌游泳体的发酵培养技术，进而生产一种能广泛适用于水源性、食源性致病菌防治以及医学、环境污染、农业、工业、军事领域等的高密度的蛭弧菌游泳体制剂。

为达到上述目的，本发明的主要技术方案如下：高密度蛭弧菌游泳体发酵培养技术，该技术的步骤及其工艺条件如下：

步骤一：宿主菌悬浮液的制备：

将宿主菌接种于常规培养基(即营养肉汤培养基)中，置于20～40℃摇床中培养12～24h，使其处于对数生长期，培养液在2～15℃，5000～8000rpm离心15～40min，保留沉淀弃去上清液，往沉淀中加入与其体积比为0.05～2％稀营养肉汤DNB培养液，即得到浓度达10¹⁸～10²⁶CFU/mL的宿主菌悬浮液，然后置于2～15℃冰箱中保存备用；

步骤二：蛭弧菌游泳体浓缩液的制备：

在稀营养肉汤DNB培养液中先加入步骤一制备的宿主菌悬浮液，使宿主菌在DNB液体中的浓度达10¹⁰～10¹⁸CFU/mL，再接入用常规方法培养出来的蛭弧菌斑，然后将此培养液在20～40℃培养20～60h，再在2～15℃，5000～8000rpm离心15～40min，保留上清液弃去沉淀，将上清液再在2～15℃，10000～20000rpm离心15～40min，保留沉淀弃去上清液，沉淀为蛭弧菌游泳体，往沉淀中加入与其体积比为0.05～2％DNB培养液，混匀即得到浓度达10⁶～10⁸PFU/mL蛭弧菌游泳体浓缩液，然后将此浓缩液置于2～15℃冰箱保存备用；

步骤三：高密度蛭弧菌游泳体的发酵培养工艺：