[发明专利]一种葡甘露聚糖酶的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种葡甘露聚糖酶的制备方法，具体来说涉及一种能降解植物类葡甘露聚糖获得葡甘露寡糖，更能有效降解酵母类细胞壁的葡甘露聚糖酶的制备方法。

背景技术

葡甘露寡糖是一种极具应用价值的低聚糖，不但广泛存在于魔芋等植物中，也是酵母类细胞壁的主要成分。葡甘露寡糖能明显促进人体肠道内益生菌的增殖，减少有毒发酵产物及有害菌的产生，是人体及动物机体良好的免疫增强剂，可作为人类功能性食品添加剂或动物饲料添加剂，对提高人类健康水平和养殖动物的饲养价值有着重要意义，而寡糖衍生物用作人类药物更有着广阔的前景。

在中国专利ZL200510034300.2中已经揭示了一种葡甘露聚糖酶的制备方法，但是用这种方法得到的葡甘露聚糖酶只能降解魔芋精粉，局限了葡甘露寡糖的获取途径。

发明内容

本发明的目的在于开发出一种新的制备高活性、用途广的葡甘露聚糖酶的方法。

我们以绿色木霉(Trichoderma viride)CGMCC 3.2942为产霉菌株，通过在含酵母细胞壁的培养基中进行菌种培养和菌曲培养，然后再经过酶液提取，沉淀酶泥，提纯等步骤，得到的葡甘露聚糖酶不但能从植物类葡甘露聚糖中降解获得葡甘露寡糖，也能降解酵母类细胞壁物质获取酵母葡甘露寡糖，从而实现了本发明的目的。

本发明的一种葡甘露聚糖酶的制备方法，其特征包括以下的步骤：

(1)菌种培养：选用绿色木霉(Trichoderma viride)CGMCC3.2942为产酶菌株，斜面培养基培养菌种，得斜面菌种；

(2)菌曲培养：将斜面菌种以常规方法制成孢子悬液，并按培养基干重计，每100g固体曲培养基接入孢子悬液8～15mL的接种量进行接种，27～30℃下恒温培养3～5天，得到菌曲，所用的固体曲培养基由质量比为1∶2.2～2.3的固体培养基和营养盐水组成，其中的固体培养基以总质量分数100％计，由蔗渣65％～73％，麸皮15％～20％，酵母细胞壁10％～15％，魔芋精粉2.0％～4.0％组成，营养盐水以总质量分数100％计，含硫酸铵0.45％～0.60％，磷酸二氢钾0.046％～0.060％，硫酸镁0.02％～0.03％，余量为水；

(3)酶液提取：将菌曲恒温浸提，过滤除渣，滤液离心去沉淀得上清液为粗酶液；

(4)沉淀酶泥：将粗酶液于冰浴中加入冷冻乙醇，沉淀分离，去上清乙醇，留沉淀，得粗酶泥；

(5)提纯：将粗酶泥用溶酶洗液溶解后，去沉淀，得葡甘露聚糖酶提纯浓酶液。

步骤(1)所述的菌种培养可以采用现有的培养基和培养方法，例如ZL200510034300.2公开的方法，最好采用下述组成的培养基：以质量份数计，由蔗渣6份，麸皮1份，酵母细胞壁1份，魔芋精粉0.5份，硫酸铵2份，磷酸二氢钾1份，硫酸镁0.05份，琼脂1.5份和水100份组成。

步骤(3)所述的酶液提取可以采用现有的方法，恒温浸提的温度最好是28～32℃，所述的滤液分离可采用常规的方法如离心分离等。

步骤(4)所述的沉淀酶泥可以采用现有的方法，冰浴温度最好是-4～-12℃，所述的沉淀分离可采用常规的方法如离心分离。

步骤(5)所述的提纯可以采用现有的方法。

步骤(5)得到的葡甘露聚糖酶提纯浓酶液还可以通过冷冻干燥，得到粉状葡甘露聚糖酶。

本发明以绿色木霉为产霉菌株，以来源广泛、价廉的蔗糠为培养基主料，并添加独具诱导功能的产酶诱导物酵母细胞壁及魔芋精粉，采用传统的固体发酵法培养菌曲，酒精沉淀提取酶制剂，所得酶制剂经诱导由真菌产生，较普通由细菌产生的一类酶产品具有更广谱、更高的酶活性。因此本发明的制备方法工艺简单，设备投资少，成本低，产品提取纯化易，酶活性高，整个工艺流程安全环保无污染，得到的葡甘露聚糖酶除了能高效降解植物类葡甘露聚糖(如魔芋胶)得到葡甘露寡糖外，更能有效地降解酵母类细胞壁(主要结构为葡甘露聚糖)，获得酵母葡甘露寡糖。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。

实施例1：

将蔗渣6g，麸皮1g，魔芋精粉0.5g，琼脂1.5g，硫酸铵2g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.05g，和水100g混合，制成试管斜面培养基，灭菌。将通过紫外线诱变选育的绿色木霉(Trichodermaviride)CGMCC3.2942接种到上述斜面培养基中，28℃培养4天，得到孢子悬液150mL。