[发明专利]与癫痫相关SCN1A基因的启动子及其构建方法和临床应用

权利要求书

1、与癫痫相关的SCN1A基因启动子，其特征是：

1)基因启动子的核苷酸序列为序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；

2)由核心启动子及其上游调控区序列和5’非翻译区外显子序列构成，其中，序列表中非划线部分为核心启动子及其上游调控区序列，划线部分为5’非翻译区外显子序列。

2、根据权利要求1所述的与癫痫相关的SCN1A基因启动子，其特征是：5’非翻译区由三个外显子构成，三个外显子通过转录后加工组成成熟mRNA的5’非翻译区；外显子大小分别为86bp，92bp和49bp，分布在第一个编码外显子上游75kb片段内，第一个非编码外显子与第二个非编码外显子相之间的内含子长约为71kb，第二个非编码外显子与第三个非编码外显子之间的内含子长约4kb，第三个非编码外显子紧邻第一个编码外显子。

3、根据权利要求1所述的与癫痫相关的SCN1A基因启动子，其特征是：能使荧光素酶报告基因在神经来源的成神经纤维瘤母细胞SH-SY5Y中表达，而在非神经来源的人胚肾293细胞HEK-293中没有表达，即该启动子包含了神经性细胞特异转录功能基序。

4、根据权利要求1所述的与癫痫相关的SCN1A基因启动子，其特征是：将基因启动子与5’非翻译区所有外显子连接构成具有神经细胞来源的表达盒。

5、与癫痫相关的SCN1A基因启动子的构建方法，其特征是：

1)利用正常人的外周血制备基因组DNA，利用正常人海马组织及大脑皮质制备总RNA；

2)准备好所需的菌株、细胞株及质粒；

3)准备好所需的试剂及试剂盒，利用试剂抽提白细胞基因组DNA和脑组织总RNA；

4)以序列表中SEQ ID №：2作为引物，进行PCR扩增，获得与癫痫相关的SCN1A基因启动子序列，并构建该启动子的表达载体。

6、根据权利要求5所述的与癫痫相关的SCN1A基因启动子的制备方法，其特征是：利用5’-Full RACE法获得SCN1A基因5’非翻译区全长；具体步骤如下：

1)采用TRIzol试剂从正常人海马组织和大脑皮质中分别提取总RNA，加DNase I消化去除残存的DNA；

2)用Tobacco Acid Pyrophosphatase即TAP去掉mRNA的5’帽子结构；

3)再用T4 RNA Ligase将5’-Full RACE Adaptor连接到mRNA的5’端后，用SCN1A基因特异性引物WP79逆转录合成cDNA第1链；

4)使用5’-Full RACE Adaptor上的外侧引物与SCN1A基因特异性的外侧引物WP79进行第一轮RT-PCR反应，再用5’-Full RACE Adaptor上的内侧引物与SCN1A基因特异性的内侧引物WP80进行第二轮RT-PCR反应，高特异性地扩增到SCN1A基因cDNA 5’末端的全长序列。

7、根据权利要求5所述的与癫痫相关的SCN1A基因启动子的构建方法，其特征是：将基因启动子与5’非翻译区所有外显子连接构成具有神经细胞来源的表达盒，该表达盒的构建步骤是：

1)提取正常人白细胞的基因组DNA，以该基因组DNA作为模板，用引物WP119和WP109进行PCR扩增；

2)获取转录起始点及其上游2.5kb片段，再以该2.5kb的PCR片段及5’-Full RACE片段作为模板；

3)用2.5kb片段上游引物WP119和5’-RACE片段的下游引物WP108，进行融合PCR，获得2.7kb长的完整启动子片段；

4)该片段用Kpn I和Hind III进行双酶切反应，酶切片段克隆到pGL4.10载体上，重组质粒命名为pGL4-1A-5U；

5)构建一个不含5’非翻译区的启动子表达载体，以2.7kb长的完整启动子片段作为模板，用引物WP119和WP106扩增，PCR片段经Kpn I和Hind III双酶切后克隆到pGL4.10载体上，重组质粒命名为pGL4-1A。

8、与癫痫相关的SCN1A基因的启动子的临床应用，其特征是：将SCN1A基因启动子与5’非翻译区所有外显子连接起来构建成具有神经细胞来源的高效特异地表达盒，可用于癫痫和其它神经系统疾病患者的SCN1A基因启动子及5’非翻译区所有外显子突变的功能鉴定，以及在癫痫及其它神经系统疾病的基因治疗。

9、如权利要求8所述的与癫痫相关的SCN1A基因的启动子的临床应用，其特征是：

1)筛查癫痫患者SCN1A基因的启动子，具体步骤如下：

首先，提取癫痫的外周血基因组DNA作为PCR模板；

然后，以序列表中SEQ ID №：3作为引物，将SCN1A基因启动子区及5’非翻译区外显子分为7个片段进行PCR扩增；

2)采用仪器进行测序；

3)采用常规生物学软件分析癫痫患者SCN1A基因启动子的序列与正常人的差异；

4)将该突变位点引入到SCN1A基因启动子表达载体，检测该突变对启动子功能的影响，分析其与疾病的关系。