[发明专利]与癫痫相关SCN1A基因的启动子及其构建方法和临床应用

说明书

技术领域

本发明涉及与癫痫相关的SCN1A基因的启动子及其构建方法和临床应用，适用于癫痫及其它神经系统疾病的诊断。属于人体基因工程技术领域。

背景技术

癫痫(Epilepsy)是大脑神经元突发性异常放电，导致反复发作的大脑功能障碍的一种慢性疾病。其发病率高，病程长，对家庭及社会的影响大。离子通道的活动是神经系统电兴奋性的基础。已有研究表明：基因突变后导致离子通道结构和功能的改变以及离子通道基因表达水平的异常改变在癫痫发生中起重要作用，其中电压依赖型钠通道在动作电位的产生和传播中起关键作用，因而成为近年来癫痫及其它神经系统疾病的基础研究和临床诊断的焦点。

目前已经发现许多编码I型电压依赖型钠通道α亚基(Na_V1.1)的SCN1A基因的突变位点与癫痫发生相关，许多全面性癫痫伴热性惊厥(GEFS+)及严重性婴儿肌阵挛(SMEI)患者的SCN1A基因不同位点发生错义突变、无义突变或缺失突变等。其中一半以上的SMEI突变位点导致蛋白质翻译时被剪切(Truncation)，成为无功能蛋白(Loss of function)，这表明SCN1A基因的表达水平下降与癫痫发病密切相关。小鼠的SCN1A基因单倍敲除实验也证实：SCN1A基因单倍表达不足(Haploinsufficiency)会导致癫痫发生。最新研究发现：SCN1A基因异常表达或突变会导致海马抑制性中间神经元的兴奋性下降，而不影响海马兴奋性锥体神经元的功能，从而推断这些异常导致海马回路的兴奋性增高，引起癫痫发作。

调节基因表达的机制比较复杂，有功能蛋白的合成要受mRNA转录、蛋白质翻译以及翻译后水平的加工、包装及运输等各个因素的影响，其中转录水平的调节是最为关键的环节，由于基因启动子是mRNA转录所必需的，并且它决定了基因表达的空间、时间和表达的强度等；因此，鉴定出SCN1A基因的启动子对于癫痫患者的临床诊断，指导癫痫的治疗具有重要价值。

发明内容

本发明的第一个目的，是为了提供一种与癫痫相关的SCN1A基因启动子。

本发明的第二个目的，是为了提供一种与癫痫相关的SCN1A基因启动子的构建方法。

本发明的第三个目的，是为了提供一种与癫痫相关的SCN1A基因启动子的临床应用。

本发明的第一个目的可以通过采取如下措施达到：

与癫痫相关的SCN1A基因启动子，其特征是：

1)基因启动子的核苷酸序列为序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；

2)由核心启动子及其上游调控区序列和5’非翻译区外显子序列构成，其中，序列表中非划线部分为核心启动子及其上游调控区序列，划线部分为5’非翻译区外显子序列。

本发明的第一个目的还可以通过采取如下措施达到：

本发明的一种实施方式是：基因启动子的5’非翻译区由三个外显子和两个内含子构成，三个外显子通过转录后加工，组成成熟mRNA的5’非翻译区；成熟mRNA的5’非翻译区的结构是：外显子大小分别为86bp，92bp和49bp，分布在第一个编码外显子上游75kb片段内，第一个非编码外显子与第二个非编码外显子相之间的内含子长约为71kb，第二个非编码外显子与第三个非编码外显子之间的内含子长约4kb，第三个非编码外显子紧邻第一个编码外显子。

本发明的一种实施方式是：能使荧光素酶报告基因在神经来源的成神经纤维瘤母细胞SH-SY5Y中表达，而在非神经来源的人胚肾293细胞HEK-293中没有表达，即该启动子包含了神经性细胞特异转录功能基序。

本发明的第二个目的可以采取如下措施达到：

与癫痫相关的SCN1A基因启动子的构建方法，其特征是：

1)利用正常人的外周血制备基因组DNA，利用正常人海马组织及大脑皮质制备总RNA；

2)准备好所需的菌株、细胞株及质粒；

3)准备好所需的试剂及试剂盒，利用试剂抽提白细胞基因组DNA和脑组织总RNA；

4)以序列表中SEQ ID №：2作为引物，进行PCR扩增，获得与癫痫相关的SCN1A基因启动子序列，并构建该启动子的表达载体。

本发明的第二个目的还可以通过采取如下措施达到：

如前所述的与癫痫相关的SCN1A基因启动子的制备方法，其特征是：

利用5’-Full RACE法获得SCN1A基因5’非翻译区全长；具体步骤如下：

1)采用TRIzol试剂从正常人海马组织和大脑皮质中分别提取总RNA，加DNase I消化去除残存的DNA；