[发明专利]一种急性早幼粒细胞白血病DNA疫苗及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种急性早幼粒细胞白血病DNA疫苗，其特征在于，所述急性早幼粒细胞白血病DNA疫苗为pIRES-PML-RARα(245bp)-hGM-CSF DNA疫苗，所述DNA疫苗由pIRES质粒、PML-RARα基因和hGM-CSF基因组成，所述PML-RARα基因序列如下：

TTAACCATGCTGG

GAC CGC CTA GCC CCA GGA GCC CCG TCA TAG GAA GTG AGG TCT

TCC TGC CCA ACA GCA ACC ACG TGG CCA GTG GCG CCG GGG AGG

CAG CCA TTG AGA CCC AGA GCA GCA GTT CTG AAG AGA TAG TGC CCA

GCC CTC CCT CGC CAC CCC CTC TAC CCC GCA TCT ACA AGC CTT GCT

TTG TCT GTC AGG ACA AGT CCT CAG GCT ACT GAG

GTGATTG；

所述hGM-CSF基因序列如下：

AGGTCTAGAACCATGTGGCTGCAGAGCCTGCTGCTCTTGGGCACTGTGGC

CTGCAGCATCTCTGCACCCGCCCGCTCGCCCAGCCCCAGCACGCAGCCCT

GGGAGCATGTGAATGCCATCCAGGAGGCCCGGCGTCTCCTGAACCTGAGT

AGAGACACTGCTGCTGAGATGAATGAAACAGTAGAAGTCATCTCAGAAAT

GTTTGACCTCCAGGAGCCGACCTGCCTACAGACCCGCCTGGAGCTGTACA

AGCAGGGCCTGCGGGGCAGCCTCACCAAGCTCAAGGGCCCCTTGACCATG

ATGGCCAGCCACTACAAGCAGCACTGCCCTCCAACCCCGGAAACTTCCTG

TGCAACCCAGACTATCACCTTTGAAAGTTTCAAAGAGAACCTGAAGGACT

TTCTGCTTGTCATCCCCTTTGACTGCTGGGAGCCAGTCCAGGAGTGAATGT

CGACTCT。

2.权利要求1所述的一种急性早幼粒细胞白血病DNA疫苗的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)首先提取NB4细胞的RNA通过逆转录合成cDNA，然后利用引物PP1和PP2通过PCR扩增出PML-RARα基因；扩增的PCR产物标记为PML-RARα，其大小为245bp；

所述的PP1：5’TTAACCATGCTGGATGGACCGCCTA 3’；其中，GCTAGC为Nhe I酶切位点；

所述的PP2：5’CAACTACTCACTCAGTAGCCTGAGGACTTG 3’；其中，ACGCGT为Mlu I酶切位点；

将扩增的基因PML-RARα利用T4 DNA连接酶与pIRES质粒进行连接，插入到pIRES质粒的多克隆位点A中构建出pIRES-PML-RARα；

(2)然后通过PCR从pORF-hGM-CSF质粒中扩增出hGM-CSF基因

以pORF-hGM-CSF质粒作为模板，用引物PG1、PG2PCR扩增hGM-CSF基因，扩增的目的片断hGM-CSF基因长度为458bp；上游引物为PG1，下游引物为PG2；

所述的PG1：5’AGGACCATGTGGCTGCAGAGC 3’；其中，TCTAGA为Xba I酶切位点；

所述的PG2：5’AGAATTCACTCCTGGACTGGC 3’；其中，GTCGAC为Sal I酶切位点；

(3)将上述扩增得到的hGM-CSF基因利用T4 DNA连接酶与pIRES质粒进行连接，插入到pIRES-PML-RARα的多克隆位点B中，经过测序正确后，构建了pIRES-PML-RARα(245bp)-hGM-CSF质粒。

3.根据权利要求2所述的一种急性早幼粒细胞白血病DNA疫苗的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)扩增反应条件为：预变性94℃1min，退火60℃1min；延伸72℃1min，共进行40个循环；首次预变性为94℃3min，末次延伸为72℃10min。