[发明专利]一种急性早幼粒细胞白血病DNA疫苗及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于血液肿瘤免疫治疗技术领域，特别涉及一种急性早幼粒细胞白血病(即pIRES-PML-RARα(245bp)-hGM-CSF)DNA疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

免疫疗法治疗肿瘤与白血病是目前的一个趋势，DNA疫苗具备诸多传统疫苗所不能比拟的优势，能够诱导特异性体液免疫与细胞免疫。急性早幼粒细胞白血病(Acute promyelocytic leukemia，APL)是目前治疗效果最好的一种白血病，但肿瘤的微小残留病变(minimal residual disease，MRD)却很难被现行治疗方案根除，寻找一种能够根除APL的MRD的治疗方案迫在眉睫。

尽管针对急性早幼粒细胞白血病(Acute promyelocytic leukemia，APL)的联合化疗方案已经取得很大进展，患者的预后也有了较大改善，但肿瘤的微小残留病变(minimal residual disease，MRD)却很难被现行治疗方案彻底消灭。由于许多白血病患者体内都存在由于染色体易位所形成的融合基因，利用融合基因作为诱导产生特异性抗白血病治疗的靶点已经成为众多研究人员追求的目标。由于体外表达的蛋白不一定具有与体内蛋白一致的天然构象，而且外源蛋白进入体内后以诱导体液免疫反应为主，而DNA疫苗则能够有效地克服这些缺陷，同时诱导体液免疫和细胞免疫。利用PML-RARα(早幼粒白血病基因(PML)与维甲酸受体α(RARα)基因)融合基因制备DNA疫苗是有希望根除急性APL的MRD的方法之一。

目前对于急性早幼粒细胞白血病(Acute promyelocytic leukemia，APL)的治疗主要有传统化疗和诱导分化治疗，虽然现有的治疗方法已经能够在很大程度上提高患者的生存质量，患者的预后也有了较大改善，但肿瘤的微小残留病变(minimal residual disease，MRD)却很难被现行治疗方案彻底消灭。骨髓移植虽然能够根除MRD，但骨髓来源少，配型成功率低，高昂的移植费用以及严重的移植相关并发症限制了该疗法的推广。在化疗结束后辅以APL特异的DNA疫苗治疗是有希望根除MRD的方法之一。

大约有70％APL患者体内存PML-RARα(早幼粒白血病基因(PML)和维甲酸受体α(RARα)基因)融合基因，该融合基因是APL发病以及应用全反式维甲酸治疗有效的分子基础，是一个特异的白血病抗原。表达PML-RARα融合基因的细胞可诱导T细胞克隆性增殖，提示该细胞内的融合蛋白可以被MHC分子加工和提呈到细胞表面，因此可以利用PML-RARα融合蛋白或融合基因诱导机体产生特异性免疫应答，或者诱导机体产生针对PML-RARα的特异性CTL，达到免疫治疗的目的。Padua等研究发现利用跨越PML-RARα融合基因的融合点的基因片段构建的DNA疫苗能够在小鼠体内诱导产生特异性免疫保护作用。

目前对于制备PML-RARα基因疫苗特异性目的基因的选择尚无定论，如何筛选出具有最佳免疫原性的PML-RARα基因片段仍是此类研究所面临的核心问题。目前尚未有融合基因pIRES-PML-RARα(245bp)-hGM-CSF的构建。

发明内容

针对上述现有技术存在的不足之处，本发明的首要目的在于提供一种急性早幼粒细胞白血病DNA疫苗(即pIRES-PML-RARα(245bp)-hGM-CSF重组质粒)。该融合基因pIRES-PML-RARα(245bp)-hGM-CSF是能够在真核细胞内同时表达PML-RARα和hGM-CSF蛋白的质粒。本发明利用基因克隆和重组技术构建了急性早幼粒细胞白血病DNA疫苗(即pIRES-PML-RARα(245bp)-hGM-CSF重组质粒)，并研究了通过体外细胞转导后基因和蛋白表达；小鼠体内注射免疫后不同时期的基因和蛋白表达、抗体产生和特异性CTL效应等的效应。

本发明的另一目的在于提供上述急性早幼粒细胞白血病DNA疫苗的制备方法。

本发明的再一目的在于提供上述急性早幼粒细胞白血病DNA疫苗的应用。所述急性早幼粒细胞白血病DNA疫苗是一种能够在真核细胞中同时表达PML-RARα蛋白和hGM-CSF蛋白的DNA疫苗，它能够诱导APL患者机体产生针对APL细胞的特异性CTL从而清除患者体内的微小残留病变，达到治愈APL的目的。