[发明专利]一种大鼠远端肺动脉内皮细胞的培养方法

权利要求书

1.一种大鼠远端肺动脉内皮细胞的培养方法，它包括以下步骤组成：

(1)获取远端肺动脉：从健康大鼠心肺组织中获取远端肺动脉；

(2)获取原代培养的大鼠远端肺动脉内皮细胞：从取得的远端肺动脉中提取远端肺动脉内皮细胞，并进行原代细胞培养，获得原代培养的大鼠远端肺动脉内皮细胞；

(3)获取传代培养的大鼠远端肺动脉内皮细胞：将步骤(2)中得到的原代细胞用PBS溶液清洗后，加入0.3～0.5ml 0.1％～0.2％胰蛋白酶溶液20～37℃消化2～3分钟，当细胞出现回缩、细胞间隙增大时，吸除胰蛋白酶溶液，加入3～5ml混合培养液，使之形成细胞悬液，接种于新的培养瓶中，每2天换液一次，至细胞生长至对数生长期，即完成传代细胞培养，获得传代培养的大鼠远端肺动脉内皮细胞。

2.根据权利要求1所述的大鼠远端肺动脉内皮细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤(3)中的混合培养液为：含100U/ml的青霉素、100U/ml的链霉素和5～10％胎牛血清的PMRI 1640培养基。

3.根据权利要求1所述的大鼠远端肺动脉内皮细胞的培养方法，其特征在于：步骤(3)所述的胰蛋白酶溶液中含有0.1％的EDTA。

4.根据权利要求1所述的大鼠远端肺动脉内皮细胞的培养方法，其特征在于：步骤(3)中所述的细胞接种密度为1～2×10⁵个/ml。

5.根据权利要求1所述的大鼠远端肺动脉内皮细胞的培养方法，其特征在于：所述的步骤(1)中从健康大鼠心肺组织中获取远端肺动脉的具体步骤为：

a、取经腹腔注射150mg/kg戊巴比妥钠麻醉的大鼠心肺组织，用HBSS平衡盐溶液洗除血污；

b、将步骤a所得的心肺组织置于显微镜下，用显微镊和显微剪刀于显微镜下小心分离远端肺动脉；

c、用钝头针灸针沿步骤b所得肺动脉的远端开口纵向穿过肺动脉，当远端开口到达针灸针柄时用显微镊从肺动脉的近端开口将肺动脉翻转固定于针灸针柄，暴露内皮，两端用细铜丝结扎，剪断针灸针，获取翻转固定于针灸针柄上的远端肺动脉。

6.根据权利要求5所述的大鼠远端肺动脉内皮细胞的培养方法，其特征在于：步骤a所述的HBSS平衡盐溶液为：1000ml三蒸水中加入7.6g氯化钠、0.38g氯化钾、0.25g氯化镁、1.8g葡萄糖和2.24gHEPES配制而成。

7.根据权利要求5所述的大鼠远端肺动脉内皮细胞的培养方法，其特征在于：步骤c中的针灸针的针体直径为0.22mm，针体长度为40mm。

8.根据权利要求1所述的大鼠远端肺动脉内皮细胞的培养方法，其特征在于：所述的步骤(2)中获得原代培养的大鼠远端肺动脉内皮细胞的具体步骤为：

1)将所得的肺动脉置于0.3～0.5ml消化液中，35～37℃消化3～5分钟；

2)向步骤1)的消化液中加入1ml混合培养液后离心，800～1000r/min离心5-8分钟，分离出内皮细胞团置于混合培养液中，制成细胞悬液；

3)将步骤2)所得细胞悬液调整细胞密度至1～5×10⁴个/ml，用该细胞悬浮液以悬浮液的细胞密度为接种密度接种于细胞培养瓶中，置于37℃、5％二氧化碳孵箱中培养，每2天换液一次，至细胞生长至对数生长期，即完成原代细胞培养，获得原代培养的大鼠远端肺动脉内皮细胞。

9.根据权利要求8所述的大鼠远端肺动脉内皮细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤1)中的消化液为：在5mlHBSS平衡盐溶液中加入31mg I型胶原酶、2mg木瓜酶、10mg牛血清白蛋白和0.7mg二硫苏糖醇配制而成。

10.根据权利要求8所述的大鼠远端肺动脉内皮细胞的培养方法，其特征在于：所述的步骤2)中的混合培养液为：含100U/ml的青霉素、100U/ml的链霉素和20％胎牛血清的PMRI 1640培养基。