[发明专利]一种大鼠远端肺动脉内皮细胞的培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种细胞培养方法，尤其是一种大鼠远端肺动脉内皮细胞的培养方法，属生物技术领域。

背景技术

肺动脉内皮细胞，尤其是远端肺动脉为内皮细胞，是研究肺循环相关疾病、尤其是肺动脉高压等疾病发病机制的重要细胞材料。目前培养肺动脉内皮细胞的方法包括酶消化法和组织块贴片法，动物来源多为牛、猪等大型动物，成本较高、动物质量难以控制且来源较少，而且组织贴片法培养细胞尚有周期较长、成功率较低的缺点。而大鼠作为目前生命科学研究领域最常见、最实用、最方便的实验动物，关于以大鼠远端肺动脉为内皮细胞来源的细胞培养方法却鲜有报道，分析原因主要有以下原因：1、大鼠体形较小，心肺组织更小，用常规分离牛、猪等大型动物远端肺动脉的方法来分离大鼠的远端肺动脉难度太大、不易成功：2.分离到的大鼠远端肺动脉太细，用常规的大血管酶灌注消化法来培养大鼠远端肺动脉内皮细胞根本行不通。

发明内容

本发明的目的是提供一种大鼠远端肺动脉内皮细胞的培养方法。该培养方法技术稳定，重复性好，培养的细胞形态均一，生长良好，且具有典型的远端肺动脉内皮细胞形态及特点。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种大鼠远端肺动脉内皮细胞的培养方法，它包括以下步骤组成：

(1)获取远端肺动脉：从健康大鼠心肺组织中获取远端肺动脉；

(2)获取原代培养的大鼠远端肺动脉内皮细胞：从取得的远端肺动脉中提取远端肺动脉内皮细胞，并进行原代细胞培养，获得原代培养的大鼠远端肺动脉内皮细胞；

(3)获取传代培养的大鼠远端肺动脉内皮细胞：将步骤(2)中得到的原代细胞用PBS溶液清洗后，加入0.3～0.5ml 0.1％～0.2％胰蛋白酶溶液20～37℃消化2～3分钟，当细胞出现回缩、细胞间隙增大时，吸除胰蛋白酶溶液，加入3～5ml混合培养液，使之形成细胞悬浮液，接种于新的培养瓶中，每2天换液一次，至细胞生长至对数生长期，即完成传代细胞培养，获得传代培养的大鼠远端肺动脉内皮细胞。

所述步骤(3)中的混合培养液为：含100U/ml的青霉素、100U/ml的链霉素和5％～10％胎牛血清的PMRI 1640培养基。

步骤(3)所述的胰蛋白酶溶液中含有0.1％EDTA，所述的细胞接种密度为1～2×10⁵个/ml，以保持细胞生长有足够的空间、营养。

所述的步骤(1)中从健康大鼠心肺组织中获取远端肺动脉的具体步骤为：

a、取经腹腔注射150mg/kg戊巴比妥钠麻醉的大鼠心肺组织，用HBSS平衡盐溶液洗除血污；

b、将步骤a所得的心肺组织置于显微镜下，用显微镊和显微剪刀于显微镜下小心分离远端肺动脉；

c、用钝头针灸针沿步骤b所得肺动脉的远端开口纵向穿过肺动脉，当远端开口到达针灸针柄时用显微镊从肺动脉的近端开口将肺动脉翻转固定于针灸针柄，暴露内皮，两端用细铜丝结扎，剪断针灸针，获取翻转固定于针灸针柄上的远端肺动脉。

其中，步骤a所述的HBSS平衡盐溶液为：1000ml三蒸水中加入7.6g氯化钠、0.38g氯化钾、0.25g氯化镁、1.8g葡萄糖和2.24gHEPES(羟乙基哌嗪乙硫磺酸)配制而成。

步骤c中的针灸针的针体直径为0.22mm，针体长度为40mm。

所述的步骤(2)中获得原代培养的大鼠远端肺动脉内皮细胞的具体步骤为：

1)将所得的肺动脉置于0.3～0.5ml消化液中，35～37℃消化3～5分钟；

2)向步骤1)的消化液中加入1ml混合培养液后离心，800～1000r/min离心5-8分钟，分离出内皮细胞团置于混合培养液I中，制成细胞悬浮液；

3)将步骤2)所得细胞悬浮液调整细胞密度至1～5×10⁴个/ml，用该细胞悬浮液以悬浮液的细胞密度为接种密度接种于细胞培养瓶中，置于37℃、5％二氧化碳孵箱中培养，每2天换液一次，至细胞生长至对数生长期，即完成原代细胞培养，获得原代培养的大鼠远端肺动脉内皮细胞。

所述步骤1)中的消化液为：5mlHBSS平衡盐溶液中加入31mg I型胶原酶、2mg木瓜酶、10mg牛血清白蛋白和0.7mg二硫苏糖醇配制而成。

所述的步骤2)中的混合培养液为：含100U/ml的青霉素、100U/ml的链霉素和20％胎牛血清的PMRI 1640培养基。

本发明方法与现有技术相比具有以下有益效果：