[发明专利]用VP16替代Nanog转录激活域CD2的Nanog基因突变体、携带其的载体,构建方法及其用途

权利要求书

1.Nanog-VP16突变序列，其特征在于将编码C端转录激活域2的核苷酸序列替换为编码VP16转录激活域的核苷酸序列，所述Nanog-VP16突变序列如SEQID NO：4所示。

2.权利要求1所述的突变序列所编码的突变蛋白质，Nanog-VP16蛋白质，其特征在于氨基酸序列为SEQ ID NO：6。

3.包含权利要求1所述的突变序列的pPyCAGIP载体，其通过在所述载体的多克隆位点xhol和Notl之间插入PCR片段，所述PCR片段为权利要求1的突变序列。

4.在pCR3.1载体中构建权利要求1所述Nanog-VP16突变序列的方法，所述序列连接在pCR3.1的载体中，其包括步骤：

a.首先，用定点诱导突变的方法在Nanog-WR与Nanog-CD2间突变出一个kpnl限制性酶切位点，引物序列为SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8；

b.然后以kpnl 37℃处理4小时，在Nanog-WR和-CD2间切开，得到两个3′末端突出的粘性末端片断；

c.利用Kpnl3′-5′外切核酸酶的活性，37℃处理半小时，将Kpnl粘性末端切平，得到在WR和CD2这两个结构域间切开的Nanog缺失CD2的突变中间体；

d.以VP16上下游引物特异性扩增VP16转录激活结构域片断，所述VP16转录激活结构域片断的核苷酸序列如SEQ ID NO：3，引物序列如SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10，在下游引物SEQ ID NO：10的3′端加入一个Notl酶切位点；

e.将此VP16片断连入处理好的Nanog缺失CD2的突变中间体中，则可获得以VP16转录激活结构域替换CD2的Nanog重组突变体，即Nanog-VP16突变序列。

5.权利要求1所述Nanog-VP16突变序列编码的蛋白质的用途，其在转染入小鼠胚胎干细胞促进小鼠胚胎干细胞的分化。

6.权利要求1所述Nanog-VP16突变序列编码的蛋白质的用途，其作为工具与报告基因p5N一起用于研究Nanog蛋白质其它结构域的功能。