[发明专利]用VP16替代Nanog转录激活域CD2的Nanog基因突变体、携带其的载体,构建方法及其用途

说明书

技术领域：

本发明涉及Nanog的突变体，表达该突变体的载体，以及构建突变体及载体的方法和它们的用途， 所述Nanog是一个在不依赖于LIF(白血病抑制因子)的情况下能够维持小鼠胚胎干细胞自我更新能力的转 录因子。

背景技术：

胚胎干细胞(ES)是唯一能够生成我们体内200多种细胞类型的多能性细胞，因此，具有能够通过移 植恢复患病或老化器官的无与伦比的潜力(参见，Pan，G J.等人，(2002)Cell research 12(5-6)，321-329)。 因此，基于干细胞的疗法是许多现在未解决疾病(例如糖尿病和帕金森氏病)的有前景的解决方案。但是， 需要在人ES细胞安全和有效地应用到人疾病之前必须克服难以克服的障碍。对ES细胞的基础生物学研究 提供了对这些障碍的合理的解决方式，例如将ES细胞维持在多能性状态并且在培养条件下将它们诱导分 化成特定的品系。

小鼠ES细胞的多能性似乎受到包括Oct4、Sox2、FoxD3和Nanog(Pan，G.J.等人，(2002)Cell research 12(5-6)，321-329；Pan，G.，等人，(2006)Faseb J20(10)，1730-1732；Boyer，L.A.，等人，(2005)Cell 122(6)， 947-956；Mitsui，K.，(2003)Cell 113(5)，631-642；Chambers，I.，(2003)Cell 113(5)，643-655)。尽管已经通过大 规模的生物学工具如微阵列核蛋白组生成了关于这些干细胞多能性核心调节子的大量数据(Boyer，L.A.， 等人，(2005)Cell 122(6)，947-956；Assou，S.等人(2007)Stem Cells 25(4)，961-973；Orkin，S.H.(2005)Cell 122(6)，828-830；Wang J.等人(2006)Nature 444(7117)，364-368)，关于控制其作用机制的分子机制知道的很 少。为此目的，我们集中研究了由Nanog所确定的转录机制，所述Nanog是已知在培养条件中没有LIF 存在时维持小鼠ES细胞自我更新的基因。我们已经在其C端定义了两个潜在的转录激活域(Pan，G.和 Thomson，J.A.(2007)Cell research 17(1)，42-49；Pan，G.，和Pei，D.(2005)J Biol chem.280(2)，1401-1407；Pan， G.J.，和Pei，D.Q.(2003)Cell research 13(6)，499-502)。它们中之一是CD2或C端结构域2，它们在基于Gal4 激活测定中已经显示为与病毒编码的VP16一样的能力。在此我们证明了在ES细胞没有LIF的情况下 Nanog介导的自我更新需要CD2。另外，我们已经揭示了CD2的转录激活活性和ES细胞自我更新所需要 的CD2中的一系列芳香氨基酸。

发明内容：

在本发明中，发明人应用了一种新的方法，将Nanog基因(序列见SEQ ID NO：1)的转录激活域CD2(序 列见SEQ ID NO：2)替换成了病毒中的一个已知更强有力的转录激活域VP16(序列见SEQ ID NO：3)，以 此来验证CD2对于Nanog转录激活活性的作用。

令人惊讶的，发明人发现，在CD2被替换成VP16，形成Nanog-VP16突变序列(SEQ ID NO：4)后， 不仅不能维持Nanog原有的维持胚胎干细胞自我更新能力的作用，而且会抑制内源Nanog的表达，从而促 进细胞向各个方向的分化。使用我们所构建的Nanog-VP16突变体，将有助于在抑制内源Nanog蛋白质(SEQ ID NO：5)表达、促进细胞分化的基础上研究Nanog的功能，并且研究胚胎干细胞分化的功能。

同时，在CD2被替换成VP16后，将使得Nanog对于其报告基因p5N(由SEQ ID NO：32(p5N正向 引物)和SEQ IDNO：33(p5N反向引物)的序列退火形成5次重复，参见Pan，G.J.和Pei，D.Q.(2005)J Biol Chem(280)(2)，1401-1407)的倍数激活高出几十倍，使得用p5N作为报告基因检测Nanog的活性更加明显。 这使得在此基础上研究Nanog的其它功能性结构域更加便捷明显。

附图说明：