[发明专利]一种建立大蕉和巴西蕉高效体细胞胚胎发生再生植株的方法

权利要求书

1.一种建立大蕉和巴西蕉高效体细胞胚胎发生再生植株的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)胚性愈伤组织的诱导：分别以大蕉或巴西蕉1～12梳未成熟雄花序为外植体，接种于愈伤组织诱导培养基上诱导出胚性愈伤组织；

(2)均一稳定的胚性细胞悬浮系的建立：挑取步骤(1)诱导出的大蕉黄色小颗粒状胚性愈伤组织或巴西蕉浅黄色小颗粒状胚性愈伤组织，分别转入M2液体培养基中，置于90～110rpm摇床上悬浮培养3～4个月即可得分散、均质的大蕉胚性细胞悬浮系或巴西蕉胚性细胞悬浮系；

(3)体细胞胚胎的诱导：在体胚诱导前先将上述胚性悬浮细胞转入不含2，4-D的M2液体培养基中预培养7～10天，随后经筛网过滤筛选出大小及生长状态一致的细胞团，从细胞团中吸取0.2～2ml 20％SCV即细胞接种量接种于含1mg·L^-1ABA和5mg·L^-1抗坏血酸的体胚诱导培养基中，置于28±1℃黑暗中进行体细胞胚胎的诱导；将诱导出的白色球形胚转入去除ABA和抗坏血酸的体胚诱导培养基中继续培养直至体胚发育成熟，得到成熟体胚；

(4)体胚的萌发及其植株再生：将步骤(3)诱导出的成熟体胚转入体胚萌发培养基中；置于28±1℃黑暗培养，待叶鞘抽出后，将其转至MR生根壮苗培养基中继续培养，进一步发育成健壮的香蕉小植株。

2.根据权利要求1所述的一种建立大蕉和巴西蕉高效体细胞胚胎发生再生植株的方法，其特征在于：所述不含2，4-D的M2液体培养基的组成为：MS基本培养基+4.1μmol·L^-1生物素+680μmol·L^-1谷氨酰胺+100mg·L^-1麦芽提取物+130mmol·L^-1蔗糖，pH5.3，高温高压灭菌。

3.根据权利要求1所述的一种建立大蕉和巴西蕉高效体细胞胚胎发生再生植株的方法，其特征在于：所述体胚诱导培养基的组成为：SH大量和微量元素及其铁盐+MS维生素+4.5μmol·L^-1生物素+680μmol·L^-1谷氨酰胺+2mmol·L^-1脯氨酸+100mg·L^-1麦芽提取物+1.1μmol·L^-1NAA+0.5μmol·L^-1激动素+44μg·L^-1玉米素+29mmol·L^-1乳糖+130m mol·L^-1蔗糖+1mg·L^-1ABA+5mg·L^-1抗坏血酸+2g·L^-1Gelrite，其中ABA和抗坏血酸事先分别配置成10mg·ml^-1母液，过滤灭菌后添加到pH5.8、经高温高压灭菌后温度降至45℃的其余培养基成分中混匀，分装于直径9.5cm的培养皿中，20～25ml/皿。

4.根据权利要求1所述的一种建立大蕉和巴西蕉高效体细胞胚胎发生再生植株的方法，其特征在于：步骤(3)中所述20％SCV悬浮细胞是按下述方法制备得到：吸取5ml悬浮细胞于15ml刻度管中，静置10分钟后，弃上清，将所得的细胞沉淀体积用不添加凝固剂Gelrite的体胚诱导培养基稀释至5倍体积。

5.根据权利要求1所述的一种建立大蕉和巴西蕉高效体细胞胚胎发生再生植株的方法，其特征在于：步骤(3)中所述经筛网过滤所得细胞团的大小范围为154μm～900μm。

6.根据权利要求1所述的一种建立大蕉和巴西蕉高效体细胞胚胎发生再生植株的方法，其特征在于：所述大蕉细胞的接种量为0.4ml 20％SCV；巴西蕉细胞的接种量为1ml 20％SCV。