[发明专利]一种建立大蕉和巴西蕉高效体细胞胚胎发生再生植株的方法

说明书

技术领域

本发明属于香蕉生物技术育种领域，特别涉及一种有效提高大蕉(MusaABB paradisiaca Linn.cv.Da Jiao)和巴西蕉(Musa AAA Cavendish cv.Baxi)胚性悬浮细胞(ECS)体胚发生频率并成功再生植株的方法。

背景技术

香蕉(包括大蕉)是世界上最重要的经济作物和农作物之一，也是许多热带亚热带国家和地区的主要粮食，为近五亿人口提供主食，是继水稻、小麦、玉米之后的第四大粮食来源。我国香蕉的总产量居全球的第三/四位，广泛种植于广东、福建、海南、广西和云南等省，产销数额一直雄居南方水果之冠，被誉称为我国南方的四大水果之一，有着巨大的经济和社会效益。但是目前香蕉病害猖獗，面临着包括真菌、细菌、病毒和生理性等多种病害的严重威胁，其中由尖孢镰刀菌引起的香蕉枯萎病能侵染绝大多数香蕉栽培品种，已经成为我国乃至世界上香蕉毁灭性的病害。我国最受大众欢迎的巴西蕉(Musa AAACavendish cv.Baxi)正是易感香蕉枯萎病的品种之一，而另一栽培种大蕉(Musa ABB paradisiaca Linn.cv.Da Jiao)已被证实具有抗香蕉枯萎病4号生理小种的优良特性，但由于其风味口感较差而市场收益不高。因此，如何培育出抗香蕉枯萎病且具有高经济效益的香蕉新种是目前香蕉产业所面临的迫切问题。然而大多数栽培蕉是无法产生种子的三倍体，难于利用传统的杂交育种方式对其种质进行改良。而包括体外诱变、转基因、体细胞杂交等生物技术育种方式有望可解决香蕉面临的上述问题。建立稳定的香蕉胚性细胞悬浮系(ECSs)及高效的经体胚发生途径的植株再生体系则是香蕉生物技术育种的前提条件。目前香蕉ECSs可通过多种途径获得，包括未成熟合子胚培养、scalps培养及未成熟花序培养。以未成熟花序为外植体是获得香蕉ECSs并经体胚发生途径获得再生植株的较有效和重复性最好的方法，应用此法已经从多个品种的香蕉中成功获得再生植株。但是这一培养体系亦存在不足之处：花序外植体的采集受抽蕾季节的限制、不同植株花序生理状态的差异、样品采集时气候的不同等诸多因素都影响该体系的稳定性，致使其胚性愈伤组织诱导率通常低于4％；胚性愈伤组织转换为理想的ECS效率及其体胚发生能力、植株转换率(通常不高于20％)均非常低下。鉴于以上技术瓶颈，目前尚未有建立巴西蕉ECS和大蕉ECS及其通过体胚发生再生植株的相关报导。

发明内容

为了克服上述现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种建立大蕉和巴西蕉高效体细胞胚胎(简称体胚)发生再生植株的方法。该方法首次建立大蕉(Musa ABB paradisiaca Linn.cv.Da Jiao)和巴西蕉(Musa AAA Cavendishcv.Baxi)的胚性细胞悬浮系，并提供一种有效的提高其体细胞胚胎发生频率成功再生植株的方法，为大蕉和巴西蕉的生物技术育种奠定基础。

本发明的目的通过下述方案实现：一种建立大蕉和巴西蕉高效体细胞胚胎发生再生植株的方法，包括如下步骤：

(1)胚性愈伤组织的诱导：分别以大蕉或巴西蕉1～12梳未成熟雄花序为外植体，接种于愈伤组织诱导培养基上诱导出胚性愈伤组织。

(2)均一稳定的胚性细胞悬浮系(ECS)的建立：挑取步骤(1)诱导出的大蕉黄色小颗粒状胚性愈伤组织或巴西蕉浅黄色小颗粒状胚性愈伤组织，分别转入M2液体培养基，置于90～110rpm摇床上悬浮培养3～4个月即可得较为分散、均质的大蕉胚性悬浮细胞或巴西蕉胚性悬浮细胞。

(3)体细胞胚胎的诱导：在体胚诱导前先将上述胚性悬浮细胞转入不含2，4-D的M2液体培养基中预培养7～10天，随后经筛网过滤筛选出大小及生长状态较一致的细胞团，从中吸取0.2～2ml 20％SCV(settled cell volume，静置10分钟后所得的细胞沉淀体积)接种于含1mg·L^-1ABA和5mg·L^-1抗坏血酸的体胚诱导培养基中，置于28±1℃黑暗中进行体细胞胚胎的诱导；将诱导出的白色球形胚转入去除ABA和抗坏血酸的体胚诱导培养基中继续培养直至体胚发育成熟，得到成熟体胚。

(4)体胚的萌发及其植株再生：将步骤(3)诱导出的成熟体胚转入体胚萌发培养基中；置于28±1℃黑暗培养，待叶鞘抽出后，将其转至MR生根壮苗培养基中继续培养，进一步发育成健壮的香蕉小植株。