[发明专利]一种链霉亲和素标记的结合藻红胆素的藻蓝蛋白类荧光蛋白质的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术中色素蛋白质材料领域，具体涉及一种链霉亲和素标记的结合藻红胆素(PEB)的藻蓝蛋白类荧光蛋白质的制备方法。

背景技术

藻胆蛋白(phycobiliprotein)是蓝藻和红藻光合作用捕光复合物的功能组分。根据其吸收光谱和荧光光谱特征，藻胆蛋白可以分为藻红蛋白(phycoerythrin，简称CPE)、藻红蓝蛋白(phycoerythrocyanin，简称PEC)、藻蓝蛋白(phycocyanin，简称CPC)和变藻蓝蛋白(allophycocyanin，简称APC)。CPE、PEC、CPC和APC含alpha和beta亚基，每个亚基中藻胆色素(phycobilin)通过硫醚键与藻胆蛋白脱辅基蛋白(apo-phycobiliprotein)半胱氨酸残基的巯基共价结合，其种类及其与脱辅基蛋白的相互作用决定藻胆蛋白的光谱性质。藻胆色素与脱辅基蛋白共价结合形成特定的构象，使得CPE主要吸收约560nm的可见光，发射约580nm的荧光；PEC吸收约570nm的可见光，发射约630nm的荧光；CPC吸收约620nm的可见光，发射约640nm的荧光；APC吸收约650～660nm的可见光，发射约660～670nm的荧光。CPE结合的辅基色素为藻红胆素(phycoerythrobilin，简称PEB)；PEC的alpha亚基结合的辅基色素为藻紫胆素(phycoviolobilin，简称PVB)；PEC的beta亚基结合的辅基色素为藻蓝胆素(phycocyanobilin，简称PCB)；CPC和APC结合的辅基色素都为藻蓝胆素PCB。

链霉亲和素可以跟生物素特异结合，通过链霉亲和素-生物素系统，可以实现信号放大作用，提高检测灵敏度。目前链霉亲和素-生物素系统已经广泛应用于生物学检测和医疗检测等领域。目前主要是通过化学交联实现链霉亲和素对目标的标记。

CPC的alpha亚基可以通过大肠杆菌基因工程菌来生产(Tooley A J，Cai Y A，GlazerA N.Biosynthesis of a fluorescent cyanobacterial C-phycocyanin holo-alpha subunitin a heterologous host[J].Proc Natl Acad Sci USA，2001，98(19)：10560～10565)。与前人的方法不同，我们发现Anabaena sp.PCC7120中all5339基因编码beta155裂合酶，在其它蓝藻中也存在同源的beta155裂合酶。这类beta155裂合酶不仅能催化藻蓝胆素PCB与CPC的beta亚基及其同源蛋白质的155位半胱氨酸巯基(或同源的半胱氨酸巯基)共价结合生成藻蓝蛋白类荧光蛋白质，还能催化藻红胆素PEB与CPC的beta亚基及其同源蛋白质的155位半胱氨酸巯基(或同源的半胱氨酸巯基)共价结合生成一种新型的结合了PEB的藻蓝蛋白类荧光蛋白质。藻红胆素PEB可由HOl、PebA、PebB协同催化生成(Alvey，R.M.，Karty，J.A.etc.Lesions in Phycoerythrin Chromophore Biosynthesis inFremyella diplosiphon Reveal Coordinated Light Regulation of Apoprotein and PigmentBiosynthetic Enzyme Gene Expression.Plant Cell 15(10)，2448-2463(2003))。通过基因工程技术，把链霉亲和素基因和藻蓝蛋白亚基脱辅基蛋白基因拼接后克隆于表达载体，可以在大肠杆菌内表达得到链霉亲和素和藻蓝蛋白亚基脱辅基蛋白的融合蛋白，直接实现链链霉亲和素和藻蓝蛋白亚基脱辅基蛋白的连接，而不需要通过化学交联等方法实现链霉亲和素标记。

藻胆蛋白类荧光蛋白质可以应用于食品、化妆品、医药和生物工程领域。藻蓝蛋白类荧光蛋白质具有优良的荧光性质，通过直接实现链链霉亲和素和藻蓝蛋白亚基脱辅基蛋白的连接，可用于生物学检测以及医疗检测领域。这种结合PEB的新型藻蓝蛋白，为开发新型荧光探针提供了更多的选择。本方法为藻蓝蛋白类色素蛋白质功能材料应用于食品、化妆品、医药和生物工程领域奠定了基础。

发明内容