[发明专利]一种土壤DNA样品制备试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种土壤DNA样品制备试剂盒及其制备方法，用于变性梯度凝胶电泳分析土壤细菌多样性的DNA样品的制备，属于DNA分析技术领域。

背景技术

目前，变性梯度凝胶电泳是使用最为广泛的土壤细菌多样性分析方法，用于变性梯度凝胶电泳的DNA样品制备过程包括土壤总DNA的提取、纯化以及目标DNA的扩增。然而土壤DNA提取和纯化工艺复杂，途径多样，扩增难度大，制备过程费时费力，结果可比性差。

发明内容

本发明的发明目的是为了提供一种土壤DNA样品制备试剂盒及其制备方法，以克服现有DNA样品制备工艺复杂、难度大、费时费力的问题。

本发明的发明目的可以通过以下技术方案来实现。

一种土壤DNA样品制备试剂盒，包括盒体和隔板；盛有溶液I的试剂瓶A，盛有溶液II的试剂瓶B，盛有溶液III的试剂瓶C，盛有溶液IV的试剂瓶D，盛有悬液V的试剂瓶E，内含酸洗玻璃珠的离心管F，微型过滤器G，PCR(链式聚合酶反应)管H。

其中，溶液I为120mmol/l的磷酸盐缓冲液；溶液II的配比组成为Tris·HCl(三羟甲基氨基甲烷·盐酸)10mmol/l，EDTA(乙二胺四乙酸)1mmol/l，CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)0.2％，pH8.0；溶液III为5mol/l的醋酸铵；溶液IV为异丙醇(纯品)；悬液V的配比组成是Sephadex G752％(质量体积比)；酸洗玻璃珠0.5g，直径约0.2mm；PCR管H的体积为200μl，内盛有DNA引物各0.25μmol，Taq酶2U，4种dNTP(脱氧核糖核酸)各200μmol，1×PCR反应缓冲液100ul，冷冻干燥所得。

离心管F为2ml的离心管。

所有试剂与耗材均经无菌处理。

所述的异丙醇保存在棕色试剂瓶中。

土壤DNA样品制备步骤如下：

a)选择用于实验的环境土壤样品；

b)将用于步骤a)中的农田土壤经细胞裂解液裂解后，获得土壤中的所有微生物的基因组DNA；

c)将步骤b)获得的基因组DNA纯化后作为PCR扩增的模板；

d)选择一般用于原核生物16SrRNA(16S核糖体核糖核酸)基因扩增的通用引物对；

e)在步骤d)选择的通用引物对的正向引物的一端加上GC发卡结构；

f)按照设计的PCR反应条件进行PCR扩增；

g)将步骤f)所述的PCR扩增产物作为样品保存备用。

通过本发明技术方案设计而成的试剂盒，具有使用简便、结果稳定，可有效地节省使用者时间和成本的优点。

附图说明

图1为试剂盒组成示意图；

图2为试剂盒操作步骤示意图。

具体实施方式

下面结合附图与具体实施例进一步阐述本发明的技术特点。

1.称取待处理的干燥分散(如含水量高，10000g离心2分钟，取沉淀物备用)土壤样品0.5g的至离心管F中，加入1ml溶液I(A)，轻微旋涡震荡混匀，2000g离心1～2min，去除上清液，重复操作一次；

2.取800ul溶液II(B)(注：如果溶液II凝固，请置于60℃水浴中加热溶解)至离心管F中，剧烈旋涡震荡2～5分钟，10000g离心1～2分钟；

3.移取上清液400ul至洁净无菌的1.5ml离心管(自备)中，加入400ul溶液III(C)，4℃保温20分钟，10000g离心5～10分钟；

4.尽量吸取上清液至2ml离心管中(自备)，加入800ul溶液IV(D)，颠倒混合均匀，-20℃保温20分钟，10000g离心5～10分钟；

5.弃上清液，加入200ul TE(Tris-EDTA)溶液(或无菌水)悬浮沉淀物，得溶液②；

6.移取溶液②至凝胶过滤柱①中，1000g离心1分钟，得到滤液③；

7.加入98ul无菌超纯水至PCR管(H)中，加入2ul溶液③，盖紧盖子(注：如果所用PCR仪没有热盖，再添加10ul无菌液体石蜡)；

8.将PCR管(H)放入PCR仪中，反应温度循环设置如下：(1)94℃变性10分钟；(2)以下是10个循环，94℃变性1分钟，65℃～55℃复性1分钟，复性温度每个循环降低1℃，72℃延长1分钟；(3)以下是20个循环，94℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟；(4)72℃延长8分钟，4℃保温。

9.得到DNA样品④备用，-20℃保存。