[发明专利]一种香菇135菌种的分子标记及其获得方法与应用

权利要求书

1.一种香菇135菌种的分子标记，其特征在于：特异性PCR扩增引物对序列为5’CCTGTGACAATCAAGCTGGAAC 3’与5’AGGTCACCGTCGTCGTTGTTGT 3’；DNA片断大小为601bp。

2.一种香菇135菌种的分子标记的获得方法，包括如下步骤：

(1)菌丝培养和基因组DNA的提取；

(2)香菇菌株135的特异DNA片断的获得；

(3)特异PCR扩增引物的获得；

(4)SCAR分子标记的PCR扩增；

(5)电泳检测。

3.如权利要求2所述的一种香菇135菌种的分子标记的获得方法，其特征在于：所述步骤(2)中香菇菌株135的特异DNA片断是通过采用PCR技术，经过大量的筛选试验，在采用随机引物获得，分子量为650bp，将该片段克隆测序。

4.如权利要求3所述的一种香菇135菌种的分子标记的获得方法，其特征在于：所用随机引物序列为：CAATCGCCGT。

5.如权利要求2所述的一种香菇135菌种的分子标记的获得方法，其特征在于：所述步骤(3)中特异PCR扩增引物通过下列方法获得：以得到的DNA序列为基础，设计特异PCR扩增引物，引物对的序列如下：5’CCTGTGACAATCAAGCTGGAAC 3’和5’AGGTCACCGTCGTCGTTGTTGT 3’。

6.如权利要求2所述的一种香菇135菌种的分子标记的获得方法，其特征在于：所述步骤(1)中菌丝培养和基因组DNA的提取包括下列步骤：将低温保藏的香菇菌种转接到PDA斜面上，25℃培养活化。两周后接到100mL PD液体培养基中，25℃100r/min振荡培养两周，收集菌丝，放入-20℃冰箱冻存；用改进的CTAB法提取基因组DNA，DNA稀释至20ng/μL，-20℃冰箱贮藏备用。

7.如权利要求2所述的一种香菇135菌种的分子标记的获得方法，其特征在于：所述步骤(4)中SCAR分子标记的PCR扩增：扩增体系总体积为：25μL，扩增体系：10×PCR buffer2.5μL，25mmol/L MgCL₂ 2μL，10mmol/L dNTP 0.25L，2.5U/μL Taq DNA酶0.5μL，10μmol/L 135菌株检测专用引物对各1μL，模板DNA 1μL(浓度1ng～10ng/μL)，ddH₂O18.6μL，PCR反应条件：94℃ 1min；94℃ 15second，61℃ 15second，72℃ 1min，30个循环；72℃5min。

8.如权利要求2所述的一种香菇135菌种的分子标记的获得方法，其特征在于：所述步骤(4)中SCAR分子标记的PCR扩增反应体系中加入ITS(Internal Transcribed Spacer)，通用引物对(ITS1、ITS4)。

9.如权利要求2所述的一种香菇135菌种的分子标记的获得方法，其特征在于：所述步骤(5)电泳检测为：取步骤(4)PCR扩增产物8μL，与1μL加样缓冲液混匀，点样于1.5％的琼醋糖凝胶上，于0.5×TBE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，用EB染色，然后在凝胶成像仪上照相。

10.一种香菇135菌种的分子标记应用于香菇135菌种的快速鉴定和检测。