[发明专利]一种香菇135菌种的分子标记及其获得方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种香菇135菌种的分子标记及其获得方法与应用。

背景技术

我国香菇产量已从1983年的1.95万吨迅速发展到2005年的242万吨，占全球香菇总产量的70％以上，改写了世界食用菌产量的排行榜，并不断缩小与排行第一的双孢蘑菇产量差距，有专家预测，由于中国香菇产业的迅猛发展，在近10年内其将成为世界产量最高的食用菌。中国香菇以其惊人的发展速度，优质的品质及低廉的成本为世界菇业人士瞩目，中国香菇已风靡世界。

优质菌种在香菇单产和质量中的贡献率举足轻重，这决定了香菇菌种在香菇产业中的重要地位。1999年我国签署了《国际植物新品种保护法》，这不仅要求我们尊重其它国家的品种知识产权，同时也要加强保护我们国家自己的品种知识产权，为了建立食用菌新品种登记制度来真正保护我国的品种产权，必须首先建立成熟的品种鉴定技术，为新品种登记奠定基础。尤其日本2004年4月1日开始实行《种苗法修正案》，对我国食用菌尤其是香菇的出口构成了极大的威胁。就国内而言，香菇栽培菌种“同种异名，异种同名”的现象，不仅给菇农带来了极大的损失，影响了他们的栽培积极性，也极大地影响了中国香菇的快速发展；而且，随着大规模的工厂化栽培方式的出现，对香菇栽培菌株质量的要求越来越高，需要发展更为简便、快速、准确的菌株鉴定技术，以保证每批次的用种都准确无误。

随着分子生物学技术的快速发展，特别是分子标记和基因标记技术的建立与成熟，为发展简便、快速、准确的菌株鉴定技术提供了有效手段。SCAR(Sequence CharacterizedAmplified Region)标记是一种十分稳定的分子标记，在应用上具有迅速、简便、低成本的特点，本发明建立了香菇135菌种的SCAR分子标记，能对香菇135菌种进行快速鉴定。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供了一种香菇135菌种的分子标记及其获得方法。

本发明采用PCR技术，经过大量的筛选试验，采用随机引物(引物序列：CAATCGCCGT)获得了香菇菌株135的特异DNA片断，分子量为650bp，将该片段克隆测序，以此片段的DNA序列为基础，设计特异PCR扩增引物，引物对的序列如下：5’CCTGTGACAATCAAGCTGGAAC3’和5’AGGTCACCGTCGTCGTTGTTGT 3’。该引物对对135菌株进行PCR扩增，可以获得601bp大小的特异片段。

一种香菇135菌种的分子标记获得方法，包括下列步骤：

(1)菌丝培养和基因组DNA的提取。

(2)香菇菌株135的特异DNA片断的获得：采用PCR技术，经过大量的筛选试验，采用随机引物(引物序列：CAATCGCCGT)获得了香菇菌株135的特异DNA片断，分子量为650bp，将该片段克隆测序。

(3)特异PCR扩增引物的获得：以得到的DNA序列为基础，设计特异PCR扩增引物，引物对的序列如下：5’CCTGTGACAATCAAGCTGGAAC 3’和5’AGGTCACCGTCGTCGTTGTTGT3’。

(4)SCAR分子标记的PCR扩增：扩增体系总体积为：25μL，10×PCR buffer 2.5μL，25mmol/L MgCL₂ 2μL，10mmol/L dNTP 0.25L，2.5U/μL Taq DNA酶0.5μL，10μmol/L135菌株检测专用引物对各1μL，模板DNA 1μL(浓度1ng～10ng/μL)，ddH₂O 18.6μL。PCR反应条件：94℃ 1min；94℃ 15second，61℃ 15second，72℃ 1min，30个循环；72℃ 5min。

为了排除其它菌种的假阴性情况，在SCAR-PCR反应体系中加入ITS(InternalTranscribed Spacer)通用引物对(ITS1、ITS4)，验证所有模板DNA的完整性。

(5)电泳检测：取上述PCR扩增产物8μL，与1μL加样缓冲液混匀，点样于1.5％的琼醋糖凝胶上，于0.5X TBE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，用EB染色，然后在凝胶成像仪上照相。

采用专用135菌株检测引物对香菇菌株进行PCR扩增，香菇135菌株能扩增出分子量约为600bp的特殊DNA条带(图1)。

根据采用这一对特殊引物进行PCR扩增，以能否产生601bpDNA片段作为对香菇135菌株进行鉴定和检测的依据。