[发明专利]以GST-hDSL重组蛋白增殖人造血干细胞及祖细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及的一种生物工程技术领域的细胞增殖方法，特别的是一种以GST-hDSL重组蛋白增殖人造血干细胞及祖细胞的方法。

背景技术

造血干细胞移植已经成为逐渐增多的白血病、恶性肿瘤和某些遗传性疾病患者的临床治疗选择。造血干细胞来源于骨髓、脐带血及动员后的外周血，但由于其来源及可获得的细胞数量有限，限制了临床应用，所以造血干祖细胞的体外扩增是一个研究热点。

Notch(Notch为一条被广泛应用的，进化高度保守的细胞分化调节信号通路)通路在许多发育系统中对细胞的命运决定起着重要的调节作用，对造血系统的发生和发育也具有重要的调控作用，被认为是解决干细胞扩增的最有前途的研究方向之一。Notch通路(Notch通路由Notch受体、Notch配体和细胞内效应分子组成，hDelta-like-1简写为hDll-1，是人Notch配体之一)与其他因子协同作用可促进造血干/祖细胞体外扩增。hDSL是由hDll-1配体蛋白中的99个氨基酸组成的多肽，是目前国际上Notch配体中结构最简单、分子量最小、又具有生物活性的Notch配体。

经对现有技术的文献检索发现，Han W等在《Blood》(《血液》，2000年95卷1616-1625页)发表了题为“A soluble form of human Delta-like-1 inhibitsdifferentiation of hematopoietic progenitor cells”(“可溶性人Delta-like-1蛋白对人造血祖细胞分化的抑制”)的论文，提出纯化的GST-hDSL融合蛋白(GST为谷胱甘肽-S-转移酶)与细胞因子粒-巨噬细胞集落刺激因子、IL-1(白介素1)、IL-3(白介素3)的联合作用可以促进小鼠造血干、祖细胞的扩增，但并没有用于人造血干、祖细胞的扩增。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种以GST-hDSL重组蛋白增殖人造血干细胞及祖细胞的方法，使其实现对人造血干、祖细胞的有效扩增。

本发明是通过如下技术方案实现的，具体步骤包括：

(1)从髓、外周血或脐带血中取样，用密度梯度离心分离出单核细胞，然后用CD34分离试剂盒对CD34细胞进行标记，采用免疫磁珠技术(属现有技术)对CD34细胞进行纯化，得到CD34⁺细胞；

(2)采用含10％-20％胎牛或人血清的细胞培养基对上述CD34⁺细胞进行培养，加入细胞因子(包括粒-巨噬细胞集落刺激因子和干细胞生长因子)和浓度为5ug/ml-50ug/ml的GST-hDSL重组蛋白，培养1周，换入含10％-20％胎牛或人血清的新鲜细胞培养基，并重新加入细胞因子(包括粒-巨噬细胞集落刺激因子和干细胞生长因子)和5ug/ml-50ug/ml的GST-hDSL重组蛋白再继续培养培养扩增1周，得到增殖了的造血干细胞、祖细胞。

所述的细胞因子，包括5ng/ml-15ng/ml的粒-巨噬细胞集落刺激因子和10ng/ml-30ng/ml干细胞生长因子。

本发明所采用GST-hDSL重组蛋白是Notch通路的配体之一，通过GST-hDSL重组蛋白与位于CD34⁺造血干、祖细胞上的Notch受体结合而激活Notch通路，激活的Notch通路有维持造血干、祖自我更新促进其生长的作用，从而达到增殖造血干、祖细胞的目的。通过从CD34⁺细胞或是从总集落数(CFC)及高增殖潜能集落数(HPP-CFC)的检测对照，本发明可有效促进人造血干、祖细胞的增殖，其增殖效果为现有技术的1.2至5.3倍。本发明将在生物医药领域得到广泛的应用。

附图说明

图1为实施例1中CD34⁺造血干/祖细胞扩增情况对比示意图。

图2为实施例1中GST-hDSL重组蛋白对集落形成(CFC)的影响对比示意图。

图3为实施例1中GST-hDSL重组蛋白对高增殖潜能集落(HPP-CFC)形成的影响对比示意图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

本实施例1是在以下实施条件和技术要求条件下实施的：

(1)脐血单核细胞的制备和CD34⁺造血干、祖细胞的分离纯化