[发明专利]月季RcHsp17.8编码序列及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学、生理学以及基因工程技术领域，具体涉及一种在月季中表达的RcHsp17.8(月季热激蛋白，Rosa chinensis Heat shock protein，RcHsp17.8)的克隆，拷贝数分析，基因表达模式分析，转基因载体的构建，大肠杆菌的转化，转基因菌株的获得及其耐热、耐冷性能鉴定。

背景技术

由于“温室效应”现象日益明显，全球气温持续升高，夏季高温已成为制约植物生长和发育的主要环境因子，植物生长发育面临高温逆境的严峻挑战。热激蛋白(heat shockprotein，HSPs)是HSPs一类在有机体受到高温等逆境刺激后大量表达的蛋白，根据分子质量大小将其分成HSP110s、HSP90s、HSP70s、HSP60s和小分子热激蛋白(smHSPs)。smHSPs包括细胞质I类smHSPs、细胞质II类smHSPs、叶绿体smHSPs、线粒体smHSPs和内质网smHSPs。热激蛋白是植物对逆境胁迫短期适应的必需组成成分，对减轻逆境胁迫引起的伤害有很大的作用。有机体在受到逆境胁迫后，体内变性蛋白急剧增加，热激蛋白可以与变性蛋白结合，维持它们的可溶状态，在有Mg²⁺和ATP的存在下使解折叠的蛋白质重新折叠成有活性的构象。已有研究证明HSPs的主要功能是参与新生肽的折叠以及蛋白质变性后的复性、降解，维持胞内环境的稳定，起分子伴侣(molecular chaperones)的作用。

虽然植物热激蛋白的研究起步较晚，但已成为当今分子生物学，蛋白质生物化学和植物抗逆生理的一个重要研究内容，其中心问题是HSPs的生物学功能。许多研究表明，HSPs的生成量与生物耐热性呈正相关。也有研究表明HSPs与植物的抗冷性相关，Collins等(1995)首先证实了HSPs和耐冷性的直接关系；Adnan等(1998)证明热激下产生的smHSP能够减轻番茄冷伤害。Alvaro等(1999)实验证明，将栗子(Castanea sativa)CsHSP17.5基因转入大肠杆菌显著提高转基因菌株对高温(50℃)及低温(4℃)的耐受性。

随着生活水平的提高，园林观赏植物越来越受到人们关注，研究观赏植物对温度逆境抗性的遗传机制有广泛的应用前景。

本发明研究了一种从月季中克隆小分子热激蛋白基因，并转入大肠杆菌后提高转基因菌株对高温、低温抗性的技术，应用该技术不仅可以提高原核生物的温度抗性，而且预期可以提高转基因植物的温度抗性。

在本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中提及的月季RcHsp17.8序列及其核酸序列。

发明内容

本发明的第一目的就是提供一种新的月季基因RcHsp17.8(SEQ ID NO.1)，该基因是一个胞质Class I小分子热激蛋白基因。

本发明的第二目的是提供这种月季热激蛋白RcHsp17.8编码序列在利用转基因技术提高大肠杆菌对高温、低温耐受性的应用。

本发明一方面从月季分离出了一种DNA分子，其核苷酸序列见SEQ ID NO.1所示。它是一种小分子热激蛋白基因，该基因长度为465bp。

本发明另一方面得到了一种蛋白质分子，它编码具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽，由154个氨基酸残基组成，分子量为17885.33道尔顿，pI为8.876。

本发明还提供一种检测RcHsp17.8mRNA表达模式的方法，其步骤如下：

(1)耐热性能差异显著的两个月季品种二年生嫁接苗于25℃常温及38℃热激处理3小时，分别提取它们嫩叶的总RNA(RNAplant，市售)。

(2)利用反转录试剂盒(市售)将总RNA反转录成cDNA，然后根据RcHsp17.8的开放读框的第1-20，446-465的特异序列设计引物，进行PCR。

本发明还提供一种利用转基因技术将编码月季热激蛋白RcHSP17.8的核苷酸序列转化到大肠杆菌以提高其温度耐受性的方法，其步骤如下：

(1)将RcHSP17.8基因的开放阅读框可操作地连接于原核表达载体，形成含有该基因的原核表达载体；