[发明专利]一种基于半推理设计的基因体外定向进化体系

说明书

技术领域

本发明涉及基因体外定向进化体系，具体涉及基因合成改造、半推理 设计和基因体外定向进化。

背景技术

体外定向分子进化(Directed evolution in vitro)是发现和改造生物活 性分子的重要方法。体外定向分子进化提供了一种高效的获得多样性的方 法。DNA改组(DNA shuffling)是重要的体外分子进化技术，结合高通 量筛选能够改造许多重要的医药、工业、环境保护等商业酶。DNA改组是 与PCR技术结合的，由随机片段的同源重组和突变，而导致基因变化的一 种体外定向分子进化技术。DNA改组的成熟常规技术路线是基因经过 DNA酶处理变成随机短片段，然后经过两步PCR过程重新组装成一个完 整的全长核酸序列，此过程中引入了突变并进行了重组，实现核苷酸序列 的体外迅速进化，从而提高核苷酸序列编码的蛋白功能。

DNA改组技术的发展和成熟是在上世纪九十年代末期，进入二十一世 纪，随着PCR技术的发展和成熟，DNA改组技术更成熟，应用更广泛， 涉及的基因也更多，推动了生物工程诸多领域突飞猛进的向前发展，如农 业、化学工业、基因治疗、疫苗、蛋白药物等。目前DNA改组已取得瞩 目的成果，已经成为理论上和实践上改造和提高目标蛋白重要的手段。特 别是近年来，随着突变方法、突变体高通量筛选技术、基因结构和功能研 究方面的突破，大大提高了DNA的突变效率，推动了定向分子进化技术 的发展。目前DNA改组及相关的体外分子进化技术取得了长足的发展， DNA改组技术成为了体外分子进化的主流。

DNA改组和家族改组通过单个基因或多个家族基因产生同源重组的 突变库，并结合有效的筛选和选择策略获得具有目标性状的蛋白。该技术 的优点是不需要结构信息，也不需要了解蛋白质潜在的功能关系，但是该 方法还是有一些局限性，如必须依赖可靠快速的鉴别突变体的方法，目标 性状筛选明确易行。利用序列信息的推理设计是有益的补充，它通过定点 突变使得表达的蛋白质产生相应的特性改变。

推理设计(rational design)，也叫序列设计，是基于基因和蛋白质信 息进行基因和蛋白质序列的改造。推理设计作为基因和蛋白质体外快速改 造有其重要的一面，基因和蛋白质推理设计能够探索寻找氨基酸序列，构 造编码一系列具有人们渴望特性的蛋白质。另外突变体库的设计是序列设 计的补充，通过突变蛋白质库寻找具有新特性的蛋白质，这些突变库常常 是通过突变或重组亲本具有相似结构的蛋白质而来。

目前基因体外定向进化体系都是采用对基因进行改组突变，然后对突 变基因进行建库筛选。基因的推理设计都是对蛋白质结构清晰的基因根据 蛋白质的功能域进行设计。然而，目前还不清楚究竟是对整个基因进行突 变效果好，还是仅仅对关键的位点进行突变效果好。而且，绝大多数基因 表达产物的蛋白质结构还没有阐明，关键位点还没有清晰。另外，大多数 的基因表达和分析还存在一定的困难。因此建立一种简便高效的结合基因 全合成、半推理设计和基因体外定向进化体系，在为改造许多重要的医药、 工业、农业、环境保护等商业酶提供高效多样性方面具有重要的应用价值。

发明内容

本发明的目的为建立一种简便高效的基于半推理设计的基因体外定 向进化体系，为改造基因和蛋白质提供更加简便且准确的突变群体，结合 筛选体系获得改良的基因或蛋白质。

本发明所提供的一种简便高效的基于半推理设计的基因体外定向进 化体系包括：1)基因改组；2)高通量筛选；3)序列分析；4)基因半推理设计； 5)基因再改组；6)高通量筛选。

本发明一种简便高效的基于半推理设计的基因体外定向进化体系建 立由下列步骤组成：

1、基因突变体库的构建：

本步骤通过DNA突变过程获得DNA片段的突变体库。DNA突变过 程包括：DNA片段的扩增、DNA片段PCR产物用DNA酶降解得到小片 段、小片段进行无引物的PCR扩增以及取无引物PCR产物为模板进行引 物PCR扩增四步。

(1)DNA片段的扩增：

根据全合成的基因核苷酸序列，合成两个寡核苷酸引物。以含有该基 因的质粒为模板，扩增得到长度为1500bp左右的该基因的DNA片段。

(2)回收DNA，回收的该基因的DNA片段用DNA酶进行降解，形 成长度为30-200bp的弥散小片段，通过透析袋回收50-100bp的小片段。