[发明专利]重组人载脂蛋白AI米兰突变体在毕赤酵母中的表达方法

权利要求书

1.一种重组人载脂蛋白AI米兰突变体在毕赤酵母中分泌表达的方法，其特征是将apoAI-milano cDNA插入表达载体pPIC9k；经Bg/II酶切后电击导入毕赤酵母GS115中，获得重组工程菌株；在BMMY培养基中进行摇瓶培养和甲醇诱导，实现rAIM的分泌表达。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于具体操作步骤如下：

(1)构建重组表达质粒

通过重组PCR方法对pPIC9k-apoAI质粒进行定点突变得到重组表达质粒pPIC9k-apoAI-milano，使apoAI cDNA的第173位Arg的密码子CGC突变成Cys的密码子TGT，突变的DNA序列经测序验证；突变后的apoAI-milano cDNA插在pPIC9k的Xho I和EcoRI位点上，大小约为747bp；

(2)筛选酵母工程菌

将重组表达质粒pPIC9k-apoAI-milano经Bg/II酶切，电击转化毕赤酵母GS115，在RDB平板上获得转化子；转化子在含G418的YPD平板上进行G418抗性筛选，获得高抗性菌株；通过摇瓶发酵和SDS-PAGE检测，筛选得到能分泌表达rAIM的酵母工程菌株；

(3)酵母工程菌株的诱导表达

将高表达的酵母工程菌株接种于BMGY培养基中，培养后分别转入常规的BMMY培养基或经过优化的BMMY培养基中进行甲醇诱导；这里所述优化的BMMY培养基中诱导；是指用KOH将BMMY培养基的pH调节到6.9-7.1，蛋白胨的用量为BMMY培养基质量的3.9-4.1％；并添加Arg和Ala以及EDTA，添加量：Arg和Ala为BMMY的0.8-1.2％r W/V，EDTA为4.5-5.5mmol/L，诱导温度为24-26℃，诱导时间为70-75小时。