[发明专利]重组人载脂蛋白AI米兰突变体在毕赤酵母中的表达方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种人载脂蛋白AI米兰突变体(AoplipoproteinI-milano，AIM)的基因工程表达方法。

背景技术

人载脂蛋白AI米兰突变体(AIM)是ApoAI的天然突变体，首次发现于意大利米兰地区一个村庄的部分居民中，其血浆中HDL上的ApoAI发生变异，即第173位的Arg突变成Cys。迄今已发现该家族有40余名AIM携带者，尽管这些居民血浆中HDL水平很低，甘油三酯水平相当高，却很少患心血管疾病，而且很长寿。研究发现含有AIM的HDL能提高胆固醇反向转运(RCT)效率。在HDL上70％Cys形成键间二硫键，30％Cys的巯基仍以游离态存在。AIM通过键间二硫键的形成，能导致同源二聚体载脂蛋白AIM/AIM或异源二聚体载脂蛋白AIM/ApoAII的产生。AIM二聚体的形成使得分子间交联折叠，形成一个新的结构域，结合脂的能力大大增强，且AIM二聚体与ApoAI单体相比，其紧密型和稳定性更好，在血浆中的半衰期也更长。由AIM与磷脂结合形成的HDL与天然的HDL相比较，前者对LCAT的激活作用还稍有增强。

迄今为止大量的动物和临床试验显示，重组AIM具有比ApoAI更强的抗动脉粥样硬化的功能，有可能成为治疗和预防动脉粥样硬化症的新药，具有临床应用前景。2006年美国洛杉矶Cedars-Sinai医学中心的研究者，通过对ApoE和ApoAI双缺陷型小鼠进行骨髓移植，使之可表达ApoAI或者AIM，之后小鼠被喂食高胆固醇食物，24周后经解剖观察到能表达AIM的小鼠动脉粥样硬化斑块减少了65％，而表达野生型ApoAI的仅减少25％。另据报道美国Esperion公司为治疗和预防动脉粥样硬化症而研制的药物ETC-216(即重组AIM/磷脂复合物)，已进入III期临床试验。

我国有近1亿人口患有动脉粥样硬化疾病，而美国和欧洲则有多达1/3的人口患有此病，该病已成为全世界发病率最高、预防和治疗花费最多的病种之一，因此抗动脉粥样硬化的药物研究正在引起重视。由于AIM不能从血浆中提取，必须依赖基因工程方法进行生产。然而由于AIM的C末端序列对蛋白酶极其敏感，因此用基因工程方法表达重组人AIM(Raim)时，极易发生该蛋白C末端的部分降解。国内有人尝试用大肠杆菌表达系统来表达rAIM，但表达的rAIM蛋白主要的以包涵体形式存在，而且会发生降解而得不到全长rAIM，从而失去其重要的生物功能。毕赤酵母表达系统具有真核生物的翻译后加工的特点，且发酵条件简单，表达水平高，表达产物活性好，因此本发明选用毕赤酵母分泌表达系统进行rAIM的表达研究，通过对酵母工程菌摇瓶培养条件的优化，使rAIM的降解得到有效抑制，其表达水平约为70mg/L发酵液，其中全长rAIM所占比例约为80％。目前在国内外均未见采用毕赤酵母表达rAIM的报道。

发明内容

本发明目的是提供一种用基因工程技术高效表达rAIM的方法。

本发明提出的用基因工程技术高效表达rAIM的方法，具体是采用DNA定点突变和DNA重组技术构建毕赤酵母重组工程菌株，经摇瓶培养和诱导，SDS-PAGE、Western blot鉴定，证明工程菌能高效分泌表达rAIM；对工程菌的摇瓶培养基和培养条件进行优化后，发酵上清液中有明显的rAIM表达，且rAIM的降解得到有效控制；用冷丙酮沉淀法部分纯化了工程菌发酵液中的表达产物rAIM，并验证了其与磷脂结合的活性。

本发明的具体操作步骤如下：

1重组表达质粒的构建

采用重组PCR法对pPIC9k-apoAI质粒(详见生物工程学报，2004，20(6)：906-911)进行定点突变得到重组表达质粒pPIC9k-apoAI-milano，使apoAI cDNA的第173位Arg的密码子(CGC)突变成Cys的密码子(TGT)。

2酵母工程菌株的筛选

重组表达质粒pPIC9K-apoAI-milano经Bg/ll酶切线性化后，电转化到毕赤酵母GS115。转化子经G418抗性筛选，获得高抗性菌株。高抗性菌株经摇瓶培养和诱导，SDS-PAGE鉴定，证明能高效分泌rAIM。

3酵母工程菌株的摇瓶培养

将高表达的酵母工程菌株接种于BMGY培养基中，培养后分别转入常规的BMMY培养基或经过优化的BMMY培养基中进行甲醇诱导。

4rAIM的SDS-PAGE、Western blot鉴定

取发酵上清液作SDS-PAGE、Western blot鉴定，证明发酵上清液中有明显的rAIM表达。