[发明专利]固相多肽合成曲普瑞林的制备方法

权利要求书

1.固相多肽合成曲普瑞林的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： 

(1)以Rink Amide AM树脂或Rink Amide MBHA树脂起始原料，按照固相合成的方法依次连接具有保护基团的氨基酸，获得保护十肽树脂，其间依次脱去Fmoc-保护基团，同步进行脱侧链保护基团； 

(2)切肽，获得粗品； 

(3)粗品经C18柱分离纯化，冻干后，制得曲普瑞林精品；

其特征在于，所说的依次连接具有保护基团的氨基酸，获得保护十肽树脂，其间依次脱去Fmoc-保护基团的方法，包括如下步骤： 

(1)制备Fmoc-Gly-树脂： 

取所说的树脂用DMF浸泡，使树脂溶胀，抽干，然后加入溶解于接肽试剂的Fmoc-Gly-OH、TBTU/HBTU和HOBt的混合物，反应，抽干，分别用DMF和乙醇洗涤，抽干，获得Fmoc-Gly-树脂；加入脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF和乙醇洗涤，抽干； 

所说的接肽试剂为：NMM∶DMF＝1∶5～15，体积比，下同； 

所说的脱帽试剂为：PIP∶DMF＝1∶2～5，体积比，下同； 

混合物中： 

树脂的重量体积浓度为5～20ml/g； 

TBTU/HBTU的摩尔数为树脂的2～6倍； 

HOBt的摩尔数为树脂的2～6倍； 

Fmoc-Gly-OH的摩尔数为树脂的2～6倍； 

树脂的重量与脱帽试剂的加入量的比例为5～20ml/g； 

(2)制备Fmoc-Pro-Gly-树脂： 

在步骤(1)的Fmoc-Gly-树脂中，加入脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF和乙醇洗涤，抽干，然后加入溶解于接肽试剂的Fmoc-Pro-OH、TBTU/HBTU、HOBT的混合物，反应，抽干，分别用DMF和乙醇洗涤，抽干，获得Fmoc-Pro-Gly-树脂；加入脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF和乙醇洗涤，抽干； 

所说的接肽试剂为：NMM∶DMF＝1∶5～15，体积比； 

所说的脱帽试剂为：PIP∶DMF＝1∶2～5，体积比； 

混合物中： 

树脂的重量体积浓度为5～20ml/g； 

TBTU/HBTU的摩尔数为树脂的2～6倍； 

HOBT的摩尔数为树脂的2～6倍； 

Fmoc-Pro-OH的摩尔数为树脂的2～6倍； 

树脂的重量与脱帽试剂的加入量的比例为5～20ml/g； 

(3)制备Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂： 

在步骤(2)的Fmoc-Pro-Gly-树脂中，加入脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF和乙醇洗涤，抽干，加入用接肽试剂溶解的Fmoc-Arg(Pbf)-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反应，抽干，分别用DMF和乙醇洗涤，抽干，获得Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂； 

混合物中： 

Fmoc-Pro-Gly-树脂的重量体积浓度为5～20ml/g； 

TBTU/HBTU的摩尔数为树脂的2～6倍； 

HOBT摩尔数为树脂的2～6倍； 

Fmoc-Arg(Pbf)-OH的摩尔数为树脂的2～6倍； 

Fmoc-Pro-Gly-树脂的重量与脱帽试剂的加入量的比例为5～20ml/g脱帽试剂； 

(4)制备Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂 

在步骤(3)的Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂中，加入脱帽试剂，20～30℃反应5～30分钟，抽干，分别用DMF和乙醇洗涤，抽干，加入用接肽试剂溶解的Fmoc-Leu-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，20～30℃反应0.5～1.5小时，抽干，分别用DMF和乙醇洗涤，抽干，获得Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂； 

混合物中： 

Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂的重量体积浓度为5～20ml/g； 

Fmoc-Leu-OH的摩尔数为树脂的2～6倍； 

Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂的重量与脱帽试剂的加入量的比例为5～20ml/g脱帽试剂；其余操作以及工艺条件同上； 

(5)制备Fmoc-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂： 

在步骤(4)的Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂中，加入脱帽试剂，20～30℃反应5～30分钟，抽干，分别用DMF和乙醇洗涤，抽干，加入用接肽试剂溶解的Fmoc-D-Trp-OH、 TBTU/HBTU和HOBT的混合物，20～30℃反应0.5～1.5小时，抽干，分别用DMF和乙醇洗涤，抽干，获得Fmoc-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂； 

混合物中： 

Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂的重量体积浓度为5～20ml/g； 

Fmoc-D-Trp-OH的摩尔数为树脂的2～6倍； 

Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂的重量与脱帽试剂的加入量的比例为5～20ml/g脱帽试剂； 

其余操作以及工艺条件同上； 

(6)制备Fmoc-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂： 

在步骤(5)的Fmoc-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂中，加入脱帽试剂，20～30℃反应5～30分钟，抽干，分别用DMF和乙醇洗涤，抽干，加入用接肽试剂溶解的Fmoc-Tyr(tBu)-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，20～30℃反应0.5～1.5小时，抽干，分别用DMF和乙醇洗涤，抽干，获得Fmoc-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂； 

混合物中： 

Fmoc-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂重量体积浓度为5～20ml/g； 

Fmoc-Tyr(tBu)-OH的摩尔数为树脂的2～6倍； 

Fmoc-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂的重量与脱帽试剂的加入量的比例为5～20ml/g脱帽试剂； 

其余操作以及工艺条件同上； 

(7)制备Fmoc-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂： 

在步骤(6)的Fmoc-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂中，加入脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF和乙醇洗涤，抽干，加入用接肽试剂溶解的Fmoc-Ser(tBu)-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反应，抽干，分别用DMF和乙醇洗涤，抽干，获得Fmoc-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂； 

混合物中： 

Fmoc-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂重量体积浓度为5～20ml/g； 

Fmoc-Ser(tBu)-OH的摩尔数为树脂的2～6倍； 

Fmoc-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂的重量与脱帽试剂的加入量的比例为5～20ml/g脱帽试剂； 

其余操作以及工艺条件同上； 

(8)制备Fmoc-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂： 

在步骤(7)的Fmoc-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂中，加入脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF和乙醇洗涤，抽干，加入用接肽试剂溶解的Fmoc-Trp-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反应，抽干，分别用DMF和乙醇洗涤，抽干，获得Fmoc-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂； 

混合物中： 

Fmoc-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂重量体积浓度为5～20ml/g； 

Fmoc-Trp-OH的摩尔数为树脂的2～6倍； 

Fmoc-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂的重量与脱帽试剂的加入量的比例为5～20ml/g脱帽试剂； 

其余操作以及工艺条件同上； 

(9)制备Fmoc-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂： 

在步骤(8)的Fmoc-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂中，加入脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF和乙醇洗涤，抽干，加入用接肽试剂溶解的Fmoc-His(Trt)-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反应，抽干，分别用DMF和乙醇洗涤，抽干，获得Fmoc-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂； 

混合物中： 

Fmoc-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂重量体积浓度为5～20ml/g； 

Fmoc-His(Trt)-OH的摩尔数为树脂的2～6倍； 

Fmoc-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂的重量与脱帽试剂的加入量的比例为5～20ml/g脱帽试剂； 

其余操作以及工艺条件同上； 

(10)制备pGlu-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂： 

在步骤(9)的Fmoc-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂中，加入脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF和乙醇洗涤，抽干，加入用接肽试剂溶解的pGlu-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反应，抽干，分别用DMF和乙醇洗涤，抽干，获得pGlu-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂； 

混合物中： 

Fmoc-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂重量体积浓度为5～20ml/g； 

pGlu-OH的摩尔数为树脂的2～6倍； 

Fmoc-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂的重量与脱帽试剂的加入量的比例为5～20ml/g脱帽试剂； 

其余操作以及工艺条件同上；

将获得的pGlu-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂，加入预冷至0～10℃的切肽试剂中，反应，收集切肽后的粗品； 

所说的切肽试剂为： 

TFA/EDT/H₂O/TIS＝680ml/18ml/18ml/3.6ml；

将曲普瑞林粗品溶于乙酸中，过滤，滤液经C18柱纯化，流速为100-650ml/min；检测波长为：280nm；用液相色谱仪跟踪收集所需要的流出液，样品峰合并后去盐，冻干，获得成品，总收率25.4，以树脂的60mmol计； 

流动相为：0.1M醋酸铵∶乙腈＝7.5∶2.5；体积比； 

乙酸的重量浓度为0.5～10％，乙酸中曲普瑞林粗品的重量浓度为1～50％，脱帽反应温度为10～60℃，反应时间为5～30分钟，接肽反应温度为10～60℃，反应时间为0.5～1.5小时，切肽温度为10～60℃，时间为1～6小时。