[发明专利]建立神经元烟碱型乙酰胆碱亚型受体细胞模型的方法

权利要求书

1.一种建立神经元烟碱型乙酰胆碱受体细胞模型的方法，其特征在于，包括如下具体步骤：

①表达载体pcDNA3.1(-)-APP695的构建，将APP695基因克隆进pcDNA3.1(-)质粒；

②将pcDNA3.1(-)-APP695用脂质体方法稳定转染进SH-EP1-α4β2细胞并用筛选抗生素进行加压筛选；

③稳定转染细胞克隆APP695 mRNA表达的鉴定，用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测APP695 mRNA表达；

④稳定转染细胞克隆APP695和Aβ蛋白表达的鉴定，用Western-blotting检测细胞克隆APP695和Aβ的表达；

⑤稳定转染细胞克隆上烟碱α4β2受体功能鉴定，用膜片钳鉴定稳定转染细胞克隆上烟碱α4β2受体的功能。

2.根据权利要求1所述的建立神经元烟碱型乙酰胆碱受体细胞模型的方法，其特征是，所述的APP695基因和pcDNA3.1(-)进行Xbal 1和Hindlll双酶切，凝胶回收后用T4 DNA连接酶连接，转化至DH5α细菌，氨苄青霉素抗性筛选重组子pcDNA3.1(-)-APP695，扩增提取质粒，测序鉴定。

3.根据权利要求1所述的建立神经元烟碱型乙酰胆碱受体细胞模型的方法，其特征是，所述的稳定转染，采用脂质体法LipofectamineTM PLUS试剂进行转染。

4.根据权利要求3所述的建立神经元烟碱型乙酰胆碱受体细胞模型的方法，其特征是，所述的稳定转染，转染3d后新霉素500g/L加压筛选，14d后细胞单克隆形成，有限稀释法将细胞进行单克隆化，2周后单克隆长满96孔板，胰酶消化，转入24孔板，长满后转入12孔板培养，待长满后收集细胞进行蛋白表达鉴定。

5.根据权利要求1或者3或者4所述的建立神经元烟碱型乙酰胆碱受体细胞模型的方法，其特征是，稳定转染34d后收集单克隆细胞，用Trizol法按说明书步骤提取细胞总RNA。以总RAN为模板，APP695引物1和引物2进行PCR。

6.根据权利要求5所述的建立神经元烟碱型乙酰胆碱受体细胞模型的方法，其特征是，PCR程序具体为：94℃变性3min进入循环过程，94℃变性1.5min，55℃退火1.5min，72℃延伸3min，循环31次后72℃复性10min。凝胶电泳鉴定PCR产物；然后用α4和β2基因引物进行PCR，α4引物为5’-CCATCGCTCAGCTCATTGACG-3’和5’-CTGGTCGGAGGGTGACTTGC-3’，β2引物为5’-TATTCCAATGCCGTGGTCTCC-3’和5’-TGGTCATCGTCCTCGCTC-3’，凝胶电泳鉴定PCR产物。

7.根据权利要求1所述的建立神经元烟碱型乙酰胆碱受体细胞模型的方法，其特征是，步骤④中检测细胞克隆APP695，是指：

对RT-PCR挑选出的阳性克隆，裂解细胞，提取细胞蛋白；

用酶标仪测定蛋白浓度，取10μg上样进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，用12％分离胶，5％积层胶，硝酸纤维素膜半干电转移，转膜时间2h，小鼠抗人APP695单抗孵育3h，山羊抗小鼠二抗孵育1h，ECL荧光检测，显影定影并拍照。

8.根据权利要求1所述的建立神经元烟碱型乙酰胆碱受体细胞模型的方法，其特征是，步骤④中检测Aβ，是指：

给药6h后用含有蛋白酶抑制剂PMSF和AEBSF的裂解液裂解细胞；

BCA法测定蛋白浓度，取30.5μg上样进行Tris-tricine电泳，用16.5％分离胶，10％夹层胶，4％浓缩胶，PVDF膜湿转，转膜时间1h，6E10单抗室温孵育3h，山羊抗小鼠二抗孵育1h，ECL荧光检测，显影定影并拍照。

9.根据权利要求1所述的建立神经元烟碱型乙酰胆碱受体细胞模型的方法，其特征是，所述的鉴定稳定转染细胞克隆上烟碱α4 β2受体的功能，是指：

对Western-bloting挑选出的APP695表达较高的细胞克隆进行膜片钳实验，采取传统的全细胞记录技术；钳制电位为-60mV，低通滤波为2kHz，采样滤波为5kHz，测试和记录软件用Axon DigiData-1200A，结果分析用Axonscope 1.1.1软件；通过微操纵器移动快速给药装置的排管给药，给予100μmol·L-1烟碱4s，观察细胞上烟碱α4β受体通道活性。