[发明专利]建立神经元烟碱型乙酰胆碱亚型受体细胞模型的方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种生物技术领域的方法，特别是一种建立神经元烟碱型乙酰胆碱亚型受体细胞模型的方法。

背景技术

淀粉样蛋白前体蛋白(amyloid protein precursor，APP)APP基因定主要以3种形式存在，分别为APP695、APP751和APP770，脑组织中主要是APP695。经过β和γ分泌酶水解剪切形成淀粉样蛋白(Aβ)。阿尔茨海默病(Alzheimerdisease，AD)的Aβ学说认为，病理状态下Aβ40及42产生增加形成寡聚体，进而形成斑块，对神经元产生多方面的毒性作用，表现为AD的一系列症状。神经元烟碱型乙酰胆碱受体广泛表达多种亚型，在中枢神经系统以α4β2亚型(由3个α亚单位和2个β亚单位组装成的五聚体)表达最为广泛。AD的Aβ学说认为，病理状态下Aβ40及42产生增加形成寡聚体，进而形成斑块，对神经元产生多方面的毒性作用，表现为AD的一系列症状。近年来关于烟碱型乙酰胆碱受体和AD的研究提示，神经元烟碱受体被认为是治疗AD药物开发的新靶点，但最为相关的受体亚型还并不清楚，针对受体亚型的药物开发也没有找到合适的筛选模型。

经对现有技术文献的检索发现，刘强在“阿尔茨海默病小鼠模型中尼古丁介导神经保护作用的信号通路机制”(Liu Q.，Zhang J.，Zhu H.，Qin C.，QinChuan.，Zhao B.1.(2007).Dissecting the signaling pathway ofnicotine-mediated neuroprotection in a mouse Alzheimer disease model.FASEB J.Research Communication：61-73.)一文中，在神经细胞发现烟碱受体激动会降低Aβ的表达，为了研究这种现象下所存在的细胞内机制，用RNA干扰技术在神经细胞进行受体亚型基因沉默，发现在亚型基因沉默后再进行烟碱受体激动，对Aβ降低作用消失。从而得出结论此种亚型受体和细胞内Aβ的水平有关，进而认为此种亚型受体在AD发病中起作用。这种用基因沉默研究烟碱受体亚型和Aβ的方法，只能得到比较浅表的此受体亚型和Aβ降低相关的结论，而不能进行深入的量化研究以及进而进行治疗和预防AD的相关化合物的筛选。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种建立神经元烟碱型乙酰胆碱受体细胞模型的方法。本发明采用脂质体转染的方法，实现了建立中枢神经系统神经元烟碱型乙酰胆碱α4β2受体亚型基因和Aβ基因共表达的细胞模型，对于观察α4β2受体激动剂对Aβ的影响，为阿尔茨海默病药物研究提供新的细胞筛选模型具有重大的实际意义。

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括如下具体步骤：

①表达载体pcDNA3.1(-)-APP695的构建：将APP695基因克隆进pcDNA3.1(-)质粒；选择Xbal 1和Hindlll为进行双酶切的工具酶。

②稳定转染：将pcDNA3.1(-)-APP695用脂质体方法转染进SH-EP1-α4β2细胞并用筛选抗生素进行加压筛选；然后用有限稀释法将细胞进行单克隆化

③稳定转染细胞克隆APP695 mRNA表达的鉴定：用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测APP695 mRNA表达；

④稳定转染细胞克隆APP695和Aβ蛋白表达的鉴定：用Western-blotting检测细胞克隆APP695和Aβ的表达；

a、检测细胞克隆APP695：

对RT-PCR挑选出的阳性克隆，裂解细胞，提取细胞蛋白；

用酶标仪测定蛋白浓度，上样进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸纤维素膜半干电转移，一抗室温孵育3h，二抗室温孵育1h，ECL荧光检测，显影定影并拍照。

b、检测Aβ：用含有蛋白酶抑制剂PMSF和AEBSF的裂解液裂解细胞；

BCA法测定蛋白浓度，上样进行Tris-tricine电泳，PVDF膜湿转，一抗室温孵育3h，二抗室温孵育1h，ECL荧光检测，显影定影并拍照。

⑤稳定转染细胞克隆上烟碱α4β2受体功能鉴定：用膜片钳鉴定稳定转染细胞克隆上烟碱α4β2受体的功能。