[发明专利]一种哺乳动物细胞rep表达质粒p5RCM1及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属生物技术和基因治疗技术领域，具体为一种含有P5MN顺式元件、用于哺乳动物细胞内反式提供rep蛋白的表达质粒及其制备和应用。

背景技术

基因治疗对于遗传性疾病的治疗有其他方法所不能替代的优势，但这种需要对患者基因组进行修饰的方法使人们对其安全性也表现出更多的忧虑。

目前有数种基因操作的转移途径，病毒载体基因转移效率高，但在安全性方面存在许多不足：如腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒载体以及慢病毒载体，可以随机整合到宿主基因组中导致插入突变。非病毒载体的基因转移效率低，外源基因表达短暂，也有随机整合的安全性问题。

关于外源基因随机插入基因组的危险已经引起轩然大波：2000年，Alain Fisher等成功治愈三名患有致命的重度复合免疫缺陷症SCID-XI的病人，成为基因治疗史上最成功的范例，然而，2002年，其中两名接受过基因治疗的SCID-XI患者被检查出患了白血病，且癌变是由于治疗时使用的逆转录病毒载体插入在靠近LMO2原癌基因的位置或该原癌基因内，激活了LMO2表达引起的。这一事件引发了对基因治疗可行性更多的争议，也对基因治疗的安全性提出了更为严格的要求(Thomas CE，Ehrhardt A，Kay MA.Progress andproblems with the use of viral vectors for gene therapy.Nat Rev Genet.2003；4：346-358)。同样是2002年，Miller等报道了去除了rep基因的重组腺相关病毒载体由于失去了定点整合的能力，其随机整合具有多变性、非精确性以及所造成的染色体缺失、重排、功能基因被打断等后果(Miller DG，Rutledge EA，Russell DW..Chromosomal effectsof adeno-associated virus vector integration.Nat Genet.2002；30：147-148)，使人们对腺相关病毒作为基因治疗载体的安全性也产生怀疑。

由于腺相关病毒是迄今为止发现的唯一可以定点整合的人类原病毒，且腺相关病毒的整合机制可以用于指导外源基因定点整合至人类基因组，腺相关病毒基因组编码的非结构蛋白非结构蛋白Rep在此过程中起着关键的作用，近年来引起了人们相当的研究兴趣。研究都认为除Rep蛋白外，AAV ITR也是外源DNA整合所必需的成分，然而，以ITR作为顺式元件构建的重组AAV载体与Rep蛋白协同作用，即使可以定点整合至宿主体内，当宿主被辅毒再次感染后体内将产生具有复制能力的携带外源基因的病毒，构成潜在危险(Linden，R.M.，E.Winocour，and K.I.Berns.1996.The recombination signalsfor adeno-associated virus site-specific integration.Proc.Natl.Acad.Sci.USA93：7966-7972)。Philpott等研究发现如果存在138bp的P5整合效率元件(P5IEE)，则只需有Rep78/68蛋白，不需要ITR也可以发生针对AAVS1的定点整合。P5IEE作为一多功能元件既是Rep78/68蛋白的调控启动子，又是介导靶向整合的主要成分(Philpott NJ，Gomos J，Berns KI et al.A p5 integration efficiency element mediates Rep-dependentintegration into AAVS1 at chromosome 19.Proc Natl Acad Sci USA.2002；99：12381-12385)。在ITR、P5IEE和人类19号染色体上的特殊整合位点AAVS1中都含有重要的整合相关的核心序列：Rep结合元件(RBE)。RBE由四个串连重复的[GAGC]₄序列构成，这四个GAGC框中部分碱基可变(Ryan，J.H.，S.Zolotukhin，and N.Muzyczka.1 996.Sequencerequirements for binding of Rep68 to the adeno-associated virus terminal repeats.J.Virol.70：1542-1553.)。最近的研究发现，rep蛋白介导的可能只需要携带目的基因的载体附加RBE元件既可以实现(Feng DM，Chen JZ，Yue YB et al.2006.A 16 bp Rep bindingelement is sufficient for mediating Rep-dependent integration into AAVS1，JOURNALOF MOLECULAR BIOLOGY 358(1)：38-45)。