[发明专利]一种检测糖尿病肾病血清标本中差异表达的蛋白质谱的方法

说明书

技术领域

本发明属生物学和医学检验领域，涉及糖尿病肾病患者体液标记物的检测方 法，具体涉及2型糖尿病肾病血清标本中差异表达的蛋白质谱的方法。

背景技术

现有技术表明，生物功能的主要体现者是蛋白质，蛋白质表达谱比mRNA表 达谱更能真实地反映生物体的功能机制。表面加强激光解吸电离飞行时间质谱 (SELDI-TOF-MS)是当前蛋白质组学研究中比较理想的技术平台，主要由蛋白质 芯片、飞行质谱和分析软件3部分组成。蛋白质芯片是核心部分，根据芯片性质 不同，可分为化学表面芯片和生物表面芯片。蛋白质芯片的问世为临床诊断及药 物发现等提供了一个大规模、高通量的分析平台。糖尿病肾病(diabetic nephropa -thy，DN)是糖尿病最严重和最常见的慢性微血管并发症之一，可累及15-25％ 的1型糖尿病及30-40％的2型糖尿病病人。鉴于糖尿病肾病的发病机制的多元性 和异质性，筛选新的糖尿病肾病患者体液标记物，尤其是诊断标记物的联合应用 可能有助于DN的更早期诊断。SELDI的出现及迅猛发展，使得快速、高效、高通量 地分析临床标本成为可能。它能够提供尿液、血液、脑脊液等粗样本的快速蛋白 表达图谱。鉴别样品间蛋白表达谱的差异，正越来越多地在癌症、自身免疫性疾 病、心血管疾病、感染性疾病的临床研究和诊断方面得到应用。利用体液标本寻 找差异蛋白，建立疾病的指纹图谱并结合计算机技术可以提高多种疾病的鉴别 率。有关SELDI-TOF-MS技术在糖尿病的研究中应用极为有限，尚未见对2型糖尿 病肾病病人血液进行大样本研究并提出分析模型的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测糖尿病肾病血清标本中差异表达的蛋白质谱 的方法。尤其是2型糖尿病肾病血清标本中差异表达的蛋白质谱的检测方法。

本发明采用表面加强激光解吸电离飞行时间质谱技术(SELDI-TOF-MS)筛选 糖尿病慢性并发症(糖尿病肾病，DN)血清样本的全蛋白指纹图谱，用数据挖掘 技术筛选DN的生物标记物，建立DN血清蛋白质组分析决策树模型，经盲法验证及 扩大样本验证模型，结果显示2型糖尿病肾病病人存在血清蛋白质指纹图谱的差 异。本发明在I-TOF-MS技术平台基础上，将某样本的血清蛋白质指纹图谱与正常 人或某种疾病的血清蛋白质指纹图谱相对照，可了解其是存有某种尚未明了的新 的特异蛋白生物标志物。本发明可进一步用于指导药物开发和疗效分析。

本发明采用的表面加强激光解吸电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)技术联 合应用蛋白质芯片技术和分子标志物模式软件建立树状分析模式，检测分析血清 标本中蛋白质谱的差异表达，其中，蛋白质芯片制备包括：(1)生物原始样品制 备。蛋白质经亲合作用结合到芯片的化学或生物位点上。(2)制备清洗的蛋白质 芯片。用水洗去非特异结合的蛋白质和缓冲液中的杂质，以消除干扰。(3)加入 能量吸收分子(Energy Absorb Molecule，EAM)。芯片干燥后，每个位点上加能 量吸收分子，与蛋白质结合为混合晶体，以促进蛋白质在SELDI检测中的解吸附 和离子化。

SELDI测定包括：(1)用激光脉冲辐射将保留在芯片上的蛋白质解析成荷电 离子。(2)不同质荷比的这些离子在仪器的磁场中的飞行时间长短不一，由此可 精确地测定出它们的质量，分子量大的飞行时间长，分子量小的飞行时间短。系 统绘出质谱图，由分析软件对质谱图进行分析，可直接显示样品中各种蛋白质含 量。

本发明方法包括下述步骤：

(1)血清标本进行蛋白裂解预处理；

(2)血清标本弱阳离子芯片处理；

(3)芯片经上样、缓冲液平衡后加能量吸收分子SPA；

(4)处理后的芯片经PBS芯片阅读仪分析获得质谱图；

(5)通过Biomarker Wizard Software 3.1比较不同组间血清蛋白质谱的 差异；

(6)利用Biomarker Patterns Software 5.0.2建立DN的分析决策树模型；

(7)应用树状分析模式获得有差异的蛋白质峰。