[发明专利]检测Dkk-1的时间分辨荧光免疫分析方法及其试剂盒

权利要求书

1、一种检测Dkk-1的时间分辨荧光免疫分析方法，其包括下列步骤：

①固相抗体制备：将抗Dkk-1单克隆抗体用缓冲液稀释至1～10mg/L作为包被液，包被反应板，并用封闭液封闭。

②铕离子标记抗体制备：选用抗Dkk-1多克隆抗体进行Eu³⁺标记，抗Dkk-1多克隆抗体与Eu³⁺标记物Eu³⁺-DTTA的重量比为1:0.2～0.5。

③测定方法：在步骤①制得的具有固相抗体的反应板上，每孔依次加入Dkk-1标准品或待测样品，加入反应缓冲液室温振荡反应，洗涤液洗涤后加入用反应缓冲液以体积比为1:100稀释的步骤②制得的标记抗体100-200ul；室温振荡反应后用洗涤液洗涤，最后加入增强液进行荧光检测。

2、如权利要求1所述的时间分辨荧光免疫分析方法，其特征在于步骤①中所述的缓冲液为50mmol/L、pH 9.6的Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液，96或48孔微孔板加入100μl包被液，4℃放置过夜，弃去包被液，用洗涤液冲洗4次，加200μl含0.2w/v％明胶和2w/v％蔗糖的50mmol/L、pH7.2的Tris-HCl缓冲液封闭，4℃放置过夜，弃去封闭液，真空抽干。

3、如权利要求1所述的时间分辨荧光免疫分析方法，其特征在于步骤③中所述的反应缓冲液为含有8mmol/L NaCl、0.1w/v％明胶、0.2w/v％IgG、50μmol/L二乙烯三胺五乙酸、0.1ml/L Tween-80和0.1w/v％NaN₃的50mmol/L、pH7.2的Tris-HCl缓冲液。

4、如权利要求1所述的时间分辨荧光免疫分析方法，其特征在于步骤③中所述的洗涤液为含有14.5mmol/LNaCl、0.2ml/L Tween-80和0.2w/v％NaN₃的50mmol/L、pH7.2的Tris-HCl缓冲液。

5、如权利要求1～4任一项所述的试剂盒，其特征在于所述的Dkk-1标准品浓度分别为：0ng/ml，12.5ng/ml，25ng/ml，50ng/ml，100ng/ml，500ng/ml。

6、一种检测Dkk-1的时间分辨荧光免疫分析的试剂盒，其包括包被有抗Dkk-1单克隆抗体的固相抗体微孔板、反应缓冲液、洗涤液、Eu³⁺标记的抗Dkk-1多克隆抗体、增强液和Dkk-1标准品。

7、如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于所述的包被抗Dkk-1单克隆抗体的固相抗体微孔板可以通过下列方法制得：用50mmol/L pH 9.6Na₂CO₃-NaHCO₃的缓冲液将抗Dkk-1单克隆抗体稀释至1～10mg/L作为包被液，96或48孔微孔板加入100μl包被液，4℃放置过夜，弃去包被液，用洗涤液冲洗4次，加200μl含0.2w/v％明胶和2w/v％蔗糖的50mmol/L、pH7.2的Tris-HCl缓冲液封闭，4℃放置过夜，弃去封闭液，真空抽干。

8、如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于所述的反应缓冲液为含有8mmol/L NaCl、0.1w/v％明胶、0.2w/v％IgG、50μmol/L二乙烯三胺五乙酸、0.1ml/L Tween-80和0.1w/v％NaN₃的50mmol/L、pH7.2的Tris-HCl缓冲液。

9、如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于所述的洗涤液为含有14.5mmol/L NaCl、0.2ml/L Tween-80和0.2w/v％NaN₃的50mmol/L、pH7.2的Tris-HCl缓冲液。

10、如权利要求6～10任一项所述的试剂盒，其特征在于所述的增强液为含有15μmol/L β-萘甲酰三氟丙酮、50μmol/L三正辛基氧化膦和1ml/L曲拉通X-100的pH3.2的邻苯二甲酸氢钾缓冲液。