[发明专利]检测Dkk-1的时间分辨荧光免疫分析方法及其试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种分泌型蛋白dickkopf l(Dkk-1)的免疫检测方法，特别涉及一种检测Dkk-1的时间分辨荧光免疫分析方法(TRFIA)及相应的试剂盒。

背景技术

Wnt信号途径是对控制胚胎发育有重要作用的、进化上保守的信号转导途径，其不恰当的激活参与了人类多种肿瘤的发生。最近的一些研究报道了参与这一信号途径的细胞内分子β-catenin、APC和AXIN的基因突变使细胞内β-catenin磷酸化水平降低和相应的泛素化降解削弱，致使稳定的β-catenin入核与TCF/LEF结合调控相关基因的表达，因而导致wnt信号途径的异常激活。分泌型蛋白dickkopf l(Dkk-1)在非洲爪蟾早期发育中发挥重要调控作用，抑制wnt诱导的轴的复制而参与头的形成。Dkk-1人类的同源物也作为一种抑制信号对Wnt信号途径起调控作用。目前的研究认为Dkk-1与低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6(low-density lipoprotein receptor-related protein 5/6，LRP 5/6)结合，在膜蛋白Kremen参与下引起LRP 5/6的内吞而抑制wnt信号。

最近有研究通过cDNA微阵列芯片技术比较肝细胞癌组织及邻近正常肝组织的基因表达差异，发现Dkk-1基因在肝细胞癌中高表达，该基因编码一个35kDa的分泌性蛋白——Dkk-1蛋白，以前对于该基因功能研究主要集中在胚胎期神经的发育。随后我们分别采用RT-PCR、Northern blot、荧光定量PCR、Western blot等技术均证实Dkk-1在人类多种肿瘤细胞系中有不同程度高表达。在今年3月出版的Cancer Research杂志上，日本学者TakumiYamabuki等报道了Dkk-1在肺癌和食道癌中的诊断作用，Dkk-1在非小细胞性肺癌的阳性率达70％，在小细胞性肺癌中的阳性率为69.4％，在食道癌中为63％，仅有4.8％的假阳性率。血清Dkk-1蛋白检测，各室验均运用ELISA原理自己建立检测方法，无商业化的试剂盒可用。ELISA方法存在稳定性差，批间差异大，灵敏度低的缺点，难以满足Dkk-1检测。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种灵敏度、特异度及稳定性较佳，且适于产业化的检测Dkk-1的时间分辨荧光免疫分析方法(TRFIA)及其试剂盒。

为提高Dkk-1检测方法的灵敏度、特异度和/或稳定性，且能产业化利用，本发明人在现有诸多免疫方法中进行筛选，惊奇地发现TRFIA在灵敏度、特异度和稳定性方面均具有良好的效果。TRFIA是上世纪八十年代初发展起来的新的免疫测定技术。其原理是利用具有双功能基团结构的螯和剂，其一端和镧系元素，如铕(Eu)、铽(Te)、钐(Sm)、镝(Dy)等结合，另一端和抗体分子上的自由氨基联接，制成镧系元素标记抗体，它与待测样品中的抗原结合成免疫复合物。理想情况下，测定复合物中镧系元素，如Eu³⁺的荧光强度就能确定样品中抗原的量，但实际上这种复合物的荧光强度相当弱，只有再加入一种增强液(Enhancement solution)，使镧系元素从复合物中解离下来，并与增强液中所含的β-萘甲酰三氟丙酮(β-NTA)重新形成微胶囊，在紫外等光的激发下发射很强的荧光，增强效果上百万倍。用全自动TRFIA检测仪测定其荧光强度，即可确定样品中抗体的量，因此本发明采用TRFIA检测Dkk-1可提高临床检验结果的速度，又可大幅度降低人为误差，适于产业化检测。

可见，本发明可以通过下列技术方案解决上述问题。一种检测Dkk-1的时间分辨荧光免疫分析方法，其可以包括下列步骤：

①固相抗体制备：将抗Dkk-1单克隆抗体用缓冲液稀释至1～10mg/L作为包被液，包被反应板，并用封闭液封闭；

②铕离子标记抗体制备：选用抗Dkk-1多克隆抗体进行Eu³⁺标记，抗Dkk-1多克隆抗体与Eu³⁺标记物Eu³⁺-DTTA的重量比为1:0.2～0.5；

③测定方法：测定的基础是基于双抗体夹心的免疫反应，包括在步骤①制得的具有固相抗体的反应板上，每孔依次加入Dkk-1标准品或待测样品，加入反应缓冲液室温振荡反应，洗涤液洗涤后加入用反应缓冲液以体积比为1：100稀释的步骤②制得的标记抗体100-200ul；室温振荡反应后用洗涤液洗涤，最后加入增强液进行荧光检测。