[发明专利]利用发光细菌检测水中急性生物毒性的方法

权利要求书

1.一种利用发光细菌检测水中急性生物毒性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

第一步，发光细菌新鲜菌悬液的制备：检测所用发光细菌为明亮发光杆菌T3小种，检测前对发光细菌进行筛选、斜面培养和摇瓶菌液培养获得初始发光度等于或者大于1.5×10⁶RLU/S的新鲜菌悬液，备用；

第二步，测试样品的处理与稀释：将测试水样和对照pH调整为：水样中的含Cu量高于其他金属以及有机物含量时为4.5，水样中不含Cu同时其它金属含量高于有机物含量时为5.4，水样中有机物含量高于金属含量时为7.0；

第三步，发光细菌新鲜菌悬液投加：取第一步制备的发光细菌新鲜菌悬液，将稳定的发光细菌新鲜菌悬液逐一加入各测试管，盖上瓶盖，用手颠倒数次，静置后测定发光度；

第四步，测试样品急性毒性的计算：采用ZnSO₄作为参比毒物，配制参比毒物系列标准溶液后分别置于管中，每管中加入第一步制备的发光细菌新鲜菌悬液，充分混匀后进行相对发光度测定，各测试水样的发光强度变化以相对发光度表示，计算公式为：样品管相对发光度＝样品管的发光度/对照管的发光度。

2.根据权利要求1所述的利用发光细菌检测水中急性生物毒性的方法，其特征是，第一步中，所述发光细菌新鲜菌悬液的制备，具体步骤为：

(1)筛选菌种：取发光细菌菌种涂布培养，挑取各种菌落细菌进行镜检，挑选出所需发光细菌的菌落；

(2)斜面菌种培养：测定前取发光细菌于新鲜斜面上接出第一代斜面，20±0.5℃培养24h后立即转接第二代斜面，20±0.5℃培养24h，再接出第三代斜面20±0.5℃培养12h后备用；

(3)摇瓶菌液培养：取第三代斜面菌种近一环，接种于装有50mL培养液的250mL三角瓶内，20±0.5℃，184rpm/min下培养12～14h备用；

(4)将培养液稀释至每毫升108～109个细胞，初始发光度等于或者大于1.5×10⁶RLU/S，备用。

3.根据权利要求2所述的利用发光细菌检测水中急性生物毒性的方法，其特征是，步骤(1)中，所述培养，其时间为48h。

4.根据权利要求2所述的利用发光细菌检测水中急性生物毒性的方法，其特征是，步骤(2)中，每次接种量等于或者小于一接种环。

5.根据权利要求1所述的利用发光细菌检测水中急性生物毒性的方法，其特征是，第二步中，所述测试样品的处理与稀释，具体为：测试水样采用蒸馏水稀释，定容前，按构成NaCl 3g/100mL浓度投加NaCl。

6.根据权利要求1所述的利用发光细菌检测水中急性生物毒性的方法，其特征是，第三步中，所述取第一步制备的发光细菌新鲜菌悬液，是指：在20～25℃条件下用微量注射器吸取按第一步制备的发光细菌新鲜菌悬液。

7.根据权利要求1所述的利用发光细菌检测水中急性生物毒性的方法，其特征是，第四步中，所述测试样品急性毒性的计算，具体为：根据不同参比毒物浓度时的相对发光度，以相对发光度为纵轴，参比毒物浓度为横轴作图并进行线性拟合，通过参比毒物浓度与相对发光度之间的相关方程，计算出相对发光度减少50％时所测样品以ZnSO₄浓度表示的EC₅₀值，通过以HgCl₂为参照毒物的平行试验可得到HgCl₂溶液的毒性为同浓度ZnSO₄溶液的12.458倍，以此换算得测试样品以HgCl₂表示的急性毒性。