[发明专利]利用发光细菌检测水中急性生物毒性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域的检测方法，具体是一种利用发光细菌检测水中急性生物毒性的方法。

背景技术

发光细菌是一种特殊的海洋细菌，它能在清洁的水中存活并发光，当水质受到污染时其发光能力会减弱。利用发光细菌在不同受污染水体中发光强度的差异可以显示水质生物急性毒性的情况。采用发光细菌法对水质进行监测具有时间短、灵敏度高的特点，而且还能弥补常规理化监测的不足，因此被广为采用。目前传统发光细菌监测方法存在结果重现性不高、使用剧毒物质氯化汞作为毒性参照物毒性较高、容易造成环境污染等问题。因此有必要对现行检测方法作进一步改进，降低参照物毒性，优化检测方法。

经对现有技术文献检索发现，GB/T 15441-1995《中华人民共和国国家标准水质急性毒性的测定发光细菌法》规定，基于发光细菌相对发光度与水样毒性组分总浓度呈显著负相关(P≤0.05)，因而可通过生物发光度计测定水样的相对发光度，以此表示其急性毒性水平。水质急性毒性水平选用相当的参比毒物氯化汞浓度(以mg/L为单位)来表征，以测试样品相对HgCl₂浓度来划分毒性等级。氯化汞是剧毒物质，购买需要繁琐的环节，使用过程中和使用后都存在一定的风险。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供了一种利用发光细菌检测水中急性生物毒性的方法，使其可取代剧毒物质氯化汞作为毒性参照物，并且可有效提高检测结果精度。本发明采用毒性相对较低的ZnSO₄代替氯化汞HgCl₂作为毒性参比，通过实验确定ZnSO₄与HgCl₂的毒性比例，在水样毒性划分时进行相应的转换，回避了剧毒物质的使用，并应用发光细菌(市售产品)达到同样的对水质急性生物毒性进行测定的目的。

本发明通过以下技术方法实现。本发明具体包括以下步骤：

第一步，发光细菌新鲜菌悬液的制备

检测所用发光细菌为明亮发光杆菌T3小种(Photobacteriumphosphoreum T3 spp.，为市售产品，在中科院南京土壤所购得)。检测前对发光细菌进行筛选、斜面培养和摇瓶菌液培养获得初始发光度不低于1.5×10⁶RLU/S的新鲜菌悬液，备用。

第二步，测试样品的处理与稀释

本发明所监测的生物急性毒性不考虑pH的影响，因此需排除pH因素。将测试水样和CK(对照)(氯化钠3g/100mL)pH调整为：水样中的含Cu量高于其他金属以及有机物含量时为4.5，水样中不含Cu同时其它金属含量高于有机物含量时为5.4，水样中有机物含量高于金属含量时为7.0；

测试水样一律采用蒸馏水稀释。定容前，按构成NaCl 3g/100mL浓度投加NaCl。

第三步，发光细菌新鲜菌悬液投加

在20～25℃条件下用微量注射器吸取按第一步制备的发光细菌新鲜菌悬液，将稳定的发光细菌新鲜菌悬液逐一加入各测试管，盖上瓶盖，用手颠倒数次，静置后测定发光度。

第四步，测试样品急性毒性的计算

参比毒物采用ZnSO₄，配制参比毒物系列标准溶液后分别置于5mLCK管中，每管中加入第一步制备的发光细菌新鲜菌悬液，充分混匀后进行相对发光度测定。各测试水样的发光强度变化以相对发光度表示，计算公式为：样品管相对发光度＝样品管的发光度(RLU/S)/CK(对照)管的发光度(RLU/S)。

根据不同参比毒物浓度时的相对发光度，以相对发光度为纵轴，参比毒物浓度为横轴作图并进行线性拟合，通过参比毒物浓度与相对发光度之间的相关方程，可计算出相对发光度减少50％时所测样品以ZnSO₄浓度表示的EC₅₀值。通过以HgCl₂为参照毒物的平行试验可得到HgCl₂溶液的毒性为同浓度ZnSO₄溶液的12.458倍，以此换算可得测试样品以HgCl₂表示的急性毒性。