[发明专利]从蝴蝶兰克隆出的类黄酮－3'5'－羟化酶基因,其编码序列和应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学、基因工程技术领域，具体涉及一种在蝴蝶兰中表达的类黄酮-3’5’-羟化酶基因的核苷酸编码序列，包含上述基因的重组表达载体，转基因植株，以及对蝴蝶兰此内源基因的表达模式进行分析鉴定的方法。

背景技术

自然界中花的颜色千变万化，这与它复杂的代谢途径和多样的代谢产物是分不开的。早在1664年，Robert Boyle就对酸碱度pH值对植物颜色的影响进行了研究。花色主要由类黄酮、类胡萝卜素以及生物碱三类物质决定。其中类黄酮类色素是一类液泡包素，主要存在液泡中，类黄酮的不同色素在液泡中的积累产生了各种花色，同时色素的组成和浓度的不同也是出现各种花色的原因。而各种色素物质的产生又是从苯丙氨酸开始沿着复杂的代谢途径由多种酶依次催化形成的。其中花色素和花色素苷是重要的颜色决定物质，也是花色生理水平的重要检测指标。而类黄酮-3’5’-羟化酶(F3’5’H)是合成3’-，5’-带羟基的花色素(例如翠雀素)的关键酶和限速酶，这类色素呈现蓝紫色，是蓝花和紫花形成的原因。因此关于它的研究就成为花色研究领域中重要的一个组成部分。

F3’，5’H基因属于细胞色素450单加氧酶(P450)超家族。细胞色素450单加氧酶(P450)是血红素依赖的氧化酶，广泛分布与各种生物中，具有非常复杂的功能，可以催化成千上万的反应。在植物界分布也非常的广泛，可以催化的反应超过50种，也涉及到类黄酮的合成。它在二氢黄酮醇的3’和5’位置选择性的加入羟基，产生不同的花色素苷从而使得植物显现出不同的颜色。

目前已经克隆得到好几种植物的F3’5’H基因，如Nielsen&Podiwinsky从草原龙胆Eustoma grandiflorum中(Nielsen KM，1997)，Okinaka从风铃草Campanμla medium中(Okinaka Y，2003)都克隆得到了F3’5’H基因。

S.T.Jeong等通过对色素的分析，发现葡萄中叶子和果实的颜色深浅与F3’5’H的表达正相关(S.T.Jeong，2005)，Effendi Leonard等从大肠杆菌(Escherichia coli)中表达了F3’5’H基因(Effendi Leonard，2005)。Yuko Fukui等将F3’5’H基因转入康乃馨中，发现花色产生了明显的变化，从粉色变成了紫色(Yuko Fukuia，2002)。YukihisaShimada等也在烟草和矮牵牛中表达了F3’5’H基因，花色均有明显的变深(YukihisaShimada，1999)。Nakatsuka T等将转座子插入F3’5’H中，从而导致基因的失活，花色从紫色变成粉色(Nakatsuka T，2006)。S.Mori等将从长春花中克隆得到的F3’5’H基因转入矮牵牛中，有些花的花色发生了变化，其中检测到了F3’5’H的表达(S.Mori，2004)。Christian Seitz等认为F3’5’H基因在某些菊科植物中的特异表达是因为蓝紫色的花瓣能够有效地吸引昆虫产生的进化(Christian Seitz，2006)。

本发明研究了一种从蝴蝶兰中克隆出的类黄酮-3’5’-羟化酶基因，转入矮牵牛后改变了花色表型。而在发明公布之前，尚未有任何公开报道过本专利申请中提及的蝴蝶兰类黄酮-3’5’-羟化酶基因序列，其蛋白序列或在转基因植株中的应用。

发明内容

本发明的目的在于提出一种从蝴蝶兰中克隆出的类黄酮-3’5’-羟化酶基因，其编码序列和应用。

本发明的一方面提供一种新的蝴蝶兰基因，记为phf3’5’h，该基因是一个类黄酮-3’5’-羟化酶基因，属于细胞色素P450家族。已注册于GenBank/EMBL/DDBJ，登陆号为：DQ148458，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供上述基因编码翻译出的蛋白序列，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种将上述的编码具有蝴蝶兰类黄酮-3’5’-羟化酶基因转入矮牵牛以改变花色的方法，具体步骤如下：

(1)将编码蝴蝶兰类黄酮-3’5’-羟化酶基因的核苷酸序列可操作的连接植物表达载体，形成含有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的载体；(见图4)

(2)将步骤(1)中的表达载体转入农杆菌，并将菌液与矮牵牛叶片混合培养。(见图5)

(3)通过抗生素筛选，PCR鉴定，获得转化细胞并再生转基因植株。