[发明专利]重组人血管内皮细胞生长因子的分离纯化、体外化学标记及其应用无效
申请号: | 200710047352.2 | 申请日: | 2007-10-24 |
公开(公告)号: | CN101418042A | 公开(公告)日: | 2009-04-29 |
发明(设计)人: | 周群敏;罗师平;周青;陶飞龙;胡红群;谢凤娟 | 申请(专利权)人: | 苏州思坦维生物技术有限责任公司 |
主分类号: | C07K14/475 | 分类号: | C07K14/475;C07K1/14;C12N15/09;C12N15/12;G01N33/68;G01N33/53;C12N5/08 |
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地址: | 215123江苏省苏州市工业园*** | 国省代码: | 江苏;32 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 重组 血管 内皮 细胞 生长因子 分离 纯化 体外 化学 标记 及其 应用 | ||
1.一种以重组基因工程及免疫亲和层析技术来制备及分离提取重组人血管内皮细胞生长因子(VEGF)蛋白的方法,其特征在于其包括下列步骤:
1)以多聚酶链式反应(RT-PCR)从健康人细胞组织中克隆获得含编码人VEGF蛋白质的cDNA;
2)克隆扩增获得的cDNA经限制性内切酶处理后,再用T4连接酶将其与经相应的限制性内切酶处理的表达载体相连,获得重组表达载体;
3)将上述重组表达载体转入真核宿主细胞,经筛选、扩增培养后获得高效稳定分泌表达重组人VEGF蛋白的宿主细胞;
4)收集细胞培养上清液,经离心及以滤膜过滤后,将滤液直接上样至含有偶联有VEGF受体蛋白或抗-VEGF抗体蛋白的亲合层析柱中;
5)亲合层析柱先经PBS洗脱后,再以低pH液洗脱回收被吸附的蛋白;
6)洗脱回收的蛋白再经调节pH至中性及透析与理化鉴定后,即获得纯化的重组人VEGF蛋白。
2.如权利要求1所述的制备及分离提取重组人VEGF蛋白的方法,其特征在于所述的用于表达重组人VEGF蛋白的真核宿主细胞包括但不局限于动物细胞、昆虫细胞及酵母细胞等。
3.如权利要求1所述的制备及分离提取重组人VEGF蛋白的方法,其特征在于所述的偶联于亲合层析柱中的VEGF受体蛋白包括但不仅限于:天然的可溶性VEGF受体(VEGF-R1、VEGF-R2及VEGF-R3)蛋白、含VEGF结合区的VEGF受体蛋白片段及重组的含VEGF结合区的VEGF受体融合蛋白等。
4.如权利要求1所述的制备及分离提提取重组人VEGF蛋白的方法,其特征在于所述的偶联于亲合层析柱中的抗-VEGF抗体蛋白包括但不仅限于:可结合人VEGF蛋白的单克隆抗体、多克隆抗体、基因工程抗体或含可结合人VEGF蛋白的抗体蛋白片段等。
5.一种带有生物素(Biotin)标记物的VEGF蛋白,其特征在于该标记的VEGF蛋白多肽中偶联有一个或多个生物素,并保持有VEGF及生物素(Biotin)的双重活性,可同时与VEGF受体结合及与亲和素(Avidin)结合。
6.一种制备如权利要求5所述的带生物素标记的VEGF蛋白的方法,其特征在于该标记方法包括下列步骤:
1)溶解VEGF蛋白质于pH为7-9的缓冲液中;
2)按标记试剂与VEGF蛋白的反应摩尔比在10:1至50:1间,加入适量的活化的生物素标记试剂与VEGF蛋白样品混合,并混匀,室温反应30-60分钟;
3)通过透析或脱盐去除未反应的过量生物素,得到生物素标记的VEGF蛋白。
7.一种以权利要求5所述的生物素标记的VEGF蛋白为主要试剂成分进行体外检测细胞或组织中的VEGF受体(VEGF-R)表达的方法,其特征在于其包括下列步骤:
1)待检细胞或组织切片以含牛血清白蛋白的封闭液温育封闭;
2)在待检细胞或组织切片上滴加经适度稀释的生物素标记的VEGF蛋白,温育1-2小时;
3)用缓冲液洗涤样品,再滴加经适度稀释的酶标记的亲和素(Avidin),温育30-60分钟;
4)用缓冲液洗涤样品,再滴加底物,温育5-10分钟或至显色;显色反应结束,于显微镜下判读检测结果。
8.一种以权利要求5所述的生物素标记的VEGF蛋白为主要试剂成分进行体外检测流离的可溶性VEGF受体(VEGF-R)的方法,其特征在于其包括下列步骤:
1)用抗人VEGF受体的抗体或其他可结合VEGF受体的配体包被ELISA板;
2)经PBS液洗脱及以含牛血清白蛋白的封闭液温育后,加入待检的样品,温育1-2h;
3)经PBS-T液洗脱后,加入经适度稀释的生物素标记的VEGF蛋白,温育1-2h;
4)经PBS-T液洗脱后,再加入经适度稀释的酶标记的亲和素(Avdin),温育1-2h;
5)经PBS-T液洗脱后,加入显色底物液,室温5-30min,或至显色;
6)加入终止反应液,以酶联免疫仪测定各孔的吸光值;根据OD值并与正常参照物(重组可溶性VEGFR受体蛋白)比较,计算出待检测的样品中所含流离的或可溶性VEGF受体蛋白的水平。
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