[发明专利]重组人血管内皮细胞生长因子的分离纯化、体外化学标记及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术邻域。本发明涉及以重组基因工程及亲和层析柱技术来制备及分离提纯具生物活性的重组VEGF蛋白；本发明还涉及对纯化的重组VEGF蛋进行体外非放射性化学偶联标记处理的方法。本发明的VEGF蛋白(包括化学偶联标记的或未标记的)在实验研究及临床上具有广泛的用途。

背景技术

血管新生或增生(angiogenesis)在生物学上是指体内的已存在的血管(如毛细血管和小静脉)通过出芽或分裂的方式而产生新的血管的过程。血管新生在维持机体的许多正常的生理过程如组织胚胎发育、外伤伤口的癒合与修复等是有益的和必需的。但过度的血管新生或增生也与许多病理变化(如肿瘤的增生扩散，炎症)息息相关。体内的血管能够不断地增生与增长的关键是其内衬的血管内皮细胞具有不断分裂增生及定向迁移置入已有的血管管壁的能力。

血管内皮细胞的分裂/增生依赖于血管内皮细胞生长因子(vascular endothelialgrowth factor，即VEGF)(Napoleone Ferrara：2004，Vascular Endothelial Growth Factor：Basic Science and Clinical Progress。Endocrine Reviews 25(4)：581-611)。VEGF在血管增生中的重要性也已在VEGF基因剔除小鼠的研究中被证实：如只要当VEGF基因中的一份被敲除，其胚胎中的新生血管即无法正常形成进而导致胚胎死亡。

人VEGF的基因全长为14kb，由8个外显子，7个内含子组成。其中由于其mRNA不同的剪接，体内至少存在有6种不同形式的VEGF蛋白(即VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF183、VEGF189及VEGF206，其中研究最多的是VEGF165)。这6种VEGF蛋白以同源二聚体可溶性糖蛋白形式存在细胞外间质或体液中，通过与特异表达在血管内皮细胞上的VEGF受体(VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3)的高度结合，从而介导出刺激血管内皮细胞分裂增生的活性。

但是体内天然的VEGF含量低且半衰期短，故一般很难提取与分离到足够量的天然的VEGF蛋白以满足实验研究及临床应用的需要。以重组基因工程及细胞培养或细菌发酵技术来体外大量表达生产重组的VEGF蛋白则是解决该问题的理想方案。但鉴于VEGF蛋白富含二硫键(S_S)结构，而二硫键对维持其三级结构及生物学活性起重要作用，故重组VEGF蛋白的表达生产策略将以在真核细胞中的分泌性表达最为理想。常见的真核表达宿主包括：哺乳动物细胞、昆虫细胞及酵母细胞等。但已有的研究表明以哺乳动物细胞表达重组VEGF蛋白，其生产成本高，不宜达到工业化规模生产。而真核单细胞生物中的酵母细胞(菌)表达系统由于兼有原核细胞的生长快速，培养方便经济，生产成本低廉，和真核细胞系统的对表达产物的加工修饰的双重特点，则是工业化生产表达外源基因如VEGF蛋白的最理想宿主。其中，近年来应用较为广泛的宿主细胞是以Pichia.pastoris(毕赤巴斯德酵母)代表的甲基营养型酵母(methylotrophic yeast)。

以毕赤酵母表达人血管内皮细胞生长因子的方法目前已有一些报导。如马骊等在2000年报导(文献1：马骊张智清陈爱君姚立红姜忠良王小宁：人血管内皮生长因子在毕赤酵母菌中的表达和鉴定。中华实验和临床病毒学杂志2000 Vol.14No.4P.309-312)：利用聚合酶链反应(PCR)技术，扩增出hVEGF165基因片段，并克隆于含AOX1启动子和α分泌信号肽序列的Pichia.pastoris酵母载体中，构建重组表达质粒pPIC9K/hVEGF165，转化酵母宿主菌KM71，筛选多拷贝整合转化子，摇瓶培养，1％甲醇诱导表达，获得高效表达且具有生物学活性的重组VEGF165。