[发明专利]携带人β珠蛋白基因的βIVS-II-654转基因小鼠模型的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种携带人β珠蛋白基因的β^IVS-II-654转基因小鼠 模型的制备方法。

背景技术

β地中海贫血是最常见的单基因遗传病之一，全世界大约有8000万携带者。β地贫主 要是β珠蛋白基因的点突变或缺失致使β珠蛋白链合成减少或完全缺乏所致的慢性贫血性 疾病，广泛流行于地中海地区、中东、东南亚和非洲，我国南部省份也是高发区。严重的 β地中海贫血表现为红细胞生成障碍和严重的贫血，需要终生输血维持生命。但是由于铁 离子的沉积，最终导致患者器官功能的衰竭而死亡。

β^IVS-II-654地中海贫血是中国人特有的一种突变类型的β地中海贫血，约占中国人β地 中海贫血的18～36％。该病由发生在第二内含子(IVS-II)的第654位(nt654)上C→T 突变引起，出现的单碱基取代产生了一个新的GT二核苷酸，联同旁侧序列构成一个新的 5’端异常的剪接位点，同时还激活了IVS-II第579位(nt579)处3’隐匿的剪接位点，从 而将IVS-2 nt580-nt652之间一段73bp内含子序列作为额外的片段插入外显子2和外显子 3之间，产生了异常的β-珠蛋白mRNA。在异常剪接的mRNA中存在一个提前的终止密 码子，使得翻译提前中止而产生极不稳定的异常β珠蛋白，这样正常β珠蛋白链合成减少， 引起α链的相对升高。过剩的α链沉积在细胞膜上，使得红细胞破坏，引起红细胞生成障 碍和溶血性贫血。

当前，治疗β地中海贫血最为有效的手段是进行造血干细胞移植，但是异体造血干细 胞的移植很难找到同型的供体，因此，通过基因修饰的自体造血干细胞移植成为二十年来 治疗的新策略。

但是，通过基因修饰的方法仍然存在着障碍。要想获得外源基因的高效表达，需要转 入较长的β珠蛋白基因序列和调控元件。既往使用的逆转录病毒载体(oncoretroviral)虽 然可以取得有效的染色体整合，但是病毒的滴度往往较低、表达不够理想并且容易发生基 因的重排。

来源于人类免疫缺陷病毒1(HIV-1)的慢病毒载体是逆转录病毒的一种，具有可以 感染非分裂期细胞、容纳外源性目的基因片段大、免疫反应小等特点而成为一种新型的基 因治疗载体系统，越来越受到人们的重视。2000年，May等人首次使用慢病毒载体(TNS9) 进行骨髓干细胞移植治疗有效地改善了β地中海贫血的症状。此后，其它研究小组也相继 证实了慢病毒载体介导治疗β地贫和其它血红蛋白疾病的效果。这为慢病毒载体应用于临 床试验展示了前景，但是，慢病毒载体所介导的基因治疗的稳定性和安全性仍需要进一步 观察。

发明内容

本发明的目的在于提供一种携带人β珠蛋白基因的β^IVS-II-654转基因小鼠模型的制备方 法，包括步骤：

A、人β珠蛋白基因片段的克隆；

B、人β珠蛋白基因启动子的克隆；

C、将人β珠蛋白基因、人β珠蛋白基因启动子克隆到载体质粒，构建携带人β珠蛋 白基因的慢病毒载体LBG；

D、将慢病毒载体LBG与包装质粒共转染细胞，培养后获得病毒颗粒；

E、将病毒颗粒进行β^IVS-II-654小鼠受精卵的卵周间隙显微注射，得到携带人β珠蛋白 基因的β^IVS-II-654转基因小鼠。

本发明的另一目的在于提供一种慢病毒载体LBG，所述慢病毒载体LBG携带有人β 珠蛋白启动子，以及人β珠蛋白基因片段。

本发明的携带了人β珠蛋白基因的β⁶⁵⁴转基因小鼠模型的基因组中稳定整合了慢病毒 载体介导的人β珠蛋白基因，并且能持续稳定的表达，而且可以遗传给后代并能维持原表 达水平。发明人通过该转基因小鼠模型，观察到慢病毒载体介导的基因治疗能够有效、稳 定地改善β地贫的症状，在转基因小鼠长期观察中没有发现其他异常变化，为在体内评价 基因治疗的效果和安全性等问题提供了有效的手段。

附图说明

图1是人β珠蛋白慢病毒表达载体构建示意图。

图2是转基因小鼠基因型鉴定PCR结果，依次为1、野生型小鼠；2、β⁶⁵⁴小鼠；3、 携带了人β珠蛋白基因的转基因小鼠；4-6、携带了人β珠蛋白基因的β⁶⁵⁴转基因小鼠 F0、F1和F2代。