[发明专利]利用重组大肠杆菌高效生产丙酮酸氧化酶的培养基

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，更具体地，本发明涉及重组大肠杆菌高效表达丙酮酸氧化酶的发酵培养基，以及利用所述的培养基生产丙酮酸氧化酶的方法。

背景技术

丙酮酸氧化酶(Pyruvate oxidase，EC 1.2.3.3)是一种非常重要的临床诊断用酶，其最重要的应用是用于血液中丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)的活力测定；此外还可以用于丙酮酸测定、丙酮酸激酶活性测定等。

目前商业化生产的丙酮酸氧化酶主要来源于野生型植物乳杆菌，酶产量较低，仅有约120U/L。尽管现有技术中已经出现了利用重组法表达丙酮酸氧化酶的方法，采用的重组菌株例如大肠杆菌E.coli DH5α/pSMLPyOD；然而，目前的重组法生产丙酮酸氧化酶的产量还不够高，一些方面的生产条件还需要进行优化。

因此，本领域迫切需要开发高产丙酮酸氧化酶的方法，并且进一步改进发酵培养基，提高产酶水平也显得十分紧迫。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生产丙酮酸氧化酶的方法。

本发明的另一目的在于提供一种特别适合于生产丙酮酸氧化酶的培养基。

在本发明的第一方面，提供一种用于培养大肠杆菌的培养基，所述的培养基含有碳源、氮源、磷源、无机盐，所述的大肠杆菌中含有表达载体，所述的表达载体中含有丙酮酸氧化酶的表达盒；其中，所述的培养基中碳源90％以上是甘油。

在另一优选例中，所述的表达盒含有与启动子操作性相连的丙酮酸氧化酶基因。

在另一优选例中，所述的培养基中碳源95％以上是甘油；更优选的，所述的培养基中碳源98％以上是甘油。

在另一优选例中，所述的大肠杆菌是E.coli DH5α/pSMLPyOD。

在另一优选例中，所述的培养基用于发酵生产丙酮酸氧化酶。

在另一优选例中，所述的氮源选自：蛋白胨，酵母提取物，硫酸铵或它们的组合。

在另一优选例中，所述的磷源是磷酸盐。

在另一优选例中，所述的无机盐选自：氯化钠，硫酸镁或它们的组合。

在另一优选例中，所述的培养基的碳源是甘油。

在另一优选例中，所述的培养基含有：

甘油          6-18ml/L

蛋白胨        12-20g/L；

酵母提取物    10-16g/L；

硫酸铵        3-7g/L；

硫酸镁        1-4g/L；

磷酸盐        4-8g/L；

氯化钠        6-15g/L。

在另一优选例中，所述的培养基含有：

甘油          8-16ml/L；

蛋白胨        12-16g/L；

酵母提取物    10-12g/L；

硫酸铵        4-6g/L；

硫酸镁        2-3g/L；

磷酸盐        5-7g/L；

氯化钠        8-12g/L。

在另一优选例中，所述的磷酸盐是复合磷酸盐，其中，K₂HPO₄∶Na₂HPO₄∶KH₂PO₄＝1∶2∶1。

在另一优选例中，所述的培养基中还含有微量元素1-2.2ml/L(优选的是1.25-2ml/L)；其中所述的微量元素含有：

FeSO₄·7H₂O        12.8±3g/L；

ZnSO₄·7H₂O        2.84±1g/L；

CuSO₄·5H₂O        1.6±0.5g/L；

MnSO₄·H₂O         3.2±1g/L；

CaCl₂              0.28±0.08g/L；

CoCl₂·6H₂O        1.6±0.5g/L；

H₃BO₄              0.24±0.08g/L；