[发明专利]猪附红细胞体的小鼠感染模型的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种生物工程技术领域的动物模型的构建方法，具体涉及一种猪附红细胞体的小鼠感染模型的构建方法。

背景技术

附红细胞体病(Eperythrozoonosis)是由附红细胞体(Eperythrozoon)寄生于红细胞表面、血浆及骨髓内引起的一种以红细胞压积降低、血红蛋白浓度下降、白细胞增多、贫血、黄疸、发热为主要临床特征的人兽共患病。该病分布范围广、感染宿主多，给人的健康和畜牧业的发展造成巨大的危害。近年来国内外医学工作者对附红细胞体病进行了深入的研究，特别是上世纪八十年代以来，报道人及畜禽等附红细胞体病的爆发流行，越来越引起了国内外学者对该病的高度重视。但是目前，附红细胞体尚不能体外大量培养和增殖，为后续研究工作带来了困难。而且该病的隐性感染率较高，且常与弓形体病，大肠杆菌病，链球菌病，温和性猪瘟等其他疾病并发感染。因此，建立一个稳定的，能反映猪附红细胞体病感染特点的动物模型对于研究该病的致病机理，免疫学，流行病学都尤为重要。

经过对现有方法的文献检索发现，附红细胞体动物模型的研究主要是通过以猪附红细胞体的全血感染切脾或注射地塞米松的实验动物来获得。如：刘冰等在2007年《中国兽医科学》37期12-15页中，描述了一种猪附红细胞体小鼠感染模型的建立方法。利用摘除脾或注射地塞米松的昆明小白鼠，以腹腔注射方式人工感染猪附红细胞体全血建立了猪附红细胞体感染模型，并通过PCR的方法进行验证。这种方法虽然也可以建立猪附红细胞体的动物模型，但是，此模型存在两个缺陷：(1)采用全血攻毒不可避免地会带入白细胞等杂质，感染源不是单一的，会影响试验结果。(2)采用免疫抑制状态下的小鼠建模，无法真实反映自然发病的状态，比较片面。因此，如果一个动物模型可以稳定地复制出附红细胞体感染，并且能克服这两个缺陷，对附红细胞体的深入研究将具有独特的价值。

发明内容

本发明要解决的技术问题，本发明提供一种猪附红细胞体的小鼠感染模型的构建方法。本发明采用分离纯化的猪附红细胞体作为感染源通过静脉注射SPF小鼠得到。本发明采用鲜血压片检测，PCR检测和透射电镜检测三种方法相结合进行验证。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明包括以下步骤：

①从感染猪附红细胞体病的猪血中分离纯化出猪附红细胞体；

所述的分离纯化的猪附红细胞体是指从猪附红细胞体病猪血中分离出来的猪附红细胞体重悬于无菌的生理盐水中，此悬液为分离纯化的猪附红细胞体悬液。

②小鼠的饲养，饲养于熏蒸消毒的隔离室内；

③对小鼠静脉接种；

所述的对小鼠静脉接种，是指对小鼠接种纯化的猪附红细胞体悬液，具体为：对7周龄SPF小鼠尾静脉注射100ul纯化的猪附红细胞体悬液，其中猪附红细胞体数目大于等于10⁷个。

④动物模型的检测，验证猪附红细胞体小鼠感染模型显示出附红细胞体感染红细胞的结构。

所述的检测，是包括鲜血压片镜检，PCR检测和透射电镜镜检三步法的综合检测。

其中PCR检测引物是根据猪附红细胞体1.8kb开放阅读框序列设计，上游为5′CTGCC GATGT GTTAA GTCCT-3′，下游为5′-CTGGG TGTAT GAAGA GTGGT GT-3′，可扩增出长度为233bp的片段。

根据上述步骤，通过三种检测方法验证，证实本发明中猪附红细胞体SPF小鼠感染模型构建成功，同时也能清楚地显示出附红细胞体感染红细胞的超微结构。

所述的感染，以分离纯化的猪附红细胞体作为感染源。由于感染源单一，使模型的建立更为标准和稳定。所述的接种，是指：静脉注射，对实验动物无需进行切脾手术或者注射地赛米松等也能获得较高的感染率。

本发明完全弥补了目前附红细胞体动物模型构建的缺陷，是一种理想的动物模型。本发明的意义在于该模型可以用于附红细胞体病的致病机理，免疫学，流行病学等方面的提供研究依据和实验手段。

附图说明

图1为实施例1附红细胞体感染红细胞的透射电镜图片。

图2为实施例2附红细胞体感染红细胞的透射电镜图片。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。