[发明专利]依博素的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及依博素的制备方法，属药物领域。

背景技术

类风湿性关节炎属于自身免疫性疾病，为常见病、多发病，目前仍缺乏有效治疗手段，在美国被列为危害人类健康的五大疾病之一，严重患者丧失工作能力。具WHO统计全世界患者达1.65亿，据了解我国患者多达2000万。科学工作者经研究发现一种具有抗白细胞介素1受体活性的微生物多糖，为链霉菌的代谢产物，命名为依博素。该微生物多糖的产生菌由中国医学科学院医药生物技术研究所分离自我国四川省峨嵋山土壤，经中国科学院微生物研究所对菌种进行分类鉴定，根据菌种形态，培养特征及分子生物学分类等研究确定其为唐得链霉菌。研究结果显示，该白细胞介素1受体拮抗剂为一种新型结构微生物胞外多糖，由8种单糖组成，其种类为鼠李糖、木糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、岩藻糖、半乳糖和半乳糖醛酸等。具有较强的抗炎作用，亦具有明显的镇痛作用，对于急性、亚急性及慢性炎症，特别对于类风湿性关节炎有显著的抑制作用，毒性很低。依博素为国内外首次报导，已申请并获得国家专利(专利申请号：99110826.4)，但是该专利对依博素的制备方法没有进行细化以及优化，没有明确原材料的种类和具体用量范围，没有对工艺中各种技术参数进行选择和有效控制，这将影响到产品的有效成分含量以及药物临床疗效；在生产过程中，对于药物生产的中间控制环节也尤为重要，也是必须考虑和注意的问题。因此，如何选择更好的产品制备方法，有效控制这种微生物多糖的质量，以获得有效明确的临床疗效，是我们药品研究工作者需要认真考虑和迫切需要解决的问题。

专利申请99110826.4说明书的实施例1中提到“放线菌139的种子和发酵培养基：葡萄糖1％，淀粉2％，黄豆粉2％，胰蛋白胨0.2％，牛肉膏0.2％，酵母粉0.4％，K₂HPO₄0.05％，CaCO₃0.3％”该发明采用同一种培养基用于种子培养和发酵培养，使得依博素的产量低下且该实施例1中所指发酵为200L小型发酵，对于工业化大生产来讲，采用这种种子培养基配方更是无法提高产量：因为在大工业发酵后期菌种密度迅速提高，代谢速度快，营养成分消耗迅速，此时必须要有更多的营养成分使得菌体充分利用并将其完全转化为自身的有效成分，从而最终达到提高产量的目的。为了弥补这一缺陷，提高产量。本发明人重新全面的查考了发酵培养基的碳，氮配比关系，通过大量的实验表明葡萄糖的浓度由1％提高到1.5％，淀粉的浓度由2％提高到2.5％，依博素纯品的产量提高60％。

专利申请99110826.4说明书的实施例2中提到“多糖的纯化工艺为大孔吸附树脂柱层析---阳离子交换树脂柱层析---沉淀----透析---阳离子凝胶层析”。由于依博素易溶于水，不溶于乙醇，故需采用醇沉来获取目的产物。但在大规模提取该类物质时，乙醇消耗量也随之大大增加，且是目的产物得率却不高，使得能源消耗严重，大大增加了生产成本；同时由于工业化大生产规模大，产量高的特点，现有的提取纯化工艺根本无法满足其要求，故本发明针对这一缺陷对提取工艺进行研究，发现在阳离子交换树脂柱层析和凝胶柱层析后均采用超滤进一步除去样品中的大量的小分子杂质，使得样品液浓缩到原来的数倍，乙醇的用量明显降低，大大的降低了生产成本，而且粗品沉淀率提高，进一步提高了该微生物多糖的产量，且获得的药物具有含量高，产量大，工艺简单可控，易于大工业生产等特点，疗效明确、抗炎镇痛作用明显。总之本发明所提供的该类微生物多糖的制备工艺不仅能满足大规模制备该微生物多糖，并且纯品的产量和质量得到很大的提高，本发明的实施必为社会，经济，环保和生态带来巨大的效益。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的提供了一种依博素的新制备方法。

本发明提供了依博素的制备方法，它包括菌种培养和多糖分离分化两个步骤：其中，菌种培养的具体步骤为：将于-70℃冷冻保存的菌种唐得链霉菌(Streptomyces tendae)接种于斜面26℃-37℃培养复壮，将培养复壮的种子斜面挖块接种至摇瓶26℃-37℃培养36-60小时，一级种子液接种于种子罐，于26℃-37℃培养36-60小时的二级种子液接种于发酵罐，于26℃-37℃培养80-160小时；

多糖分离分化的具体步骤为：板框过滤，大孔吸附树脂柱层析，阳离子交换树脂柱层析，超滤，沉淀，离心，得依博素湿沉淀物，再将依博素湿沉淀物过凝胶柱层析，洗脱液，超滤，喷雾干燥，得纯品依博素。