[发明专利]制备高纯度单唾液酸四己糖神经节苷脂的方法

权利要求书

1.一种制备高纯度单唾液酸四己糖神经节苷脂的方法，其特征在于工艺步骤包括：

(1)用新鲜家畜脑组织制备丙酮粉；

(2)制备总神经节苷脂

将步骤(1)制备的丙酮粉在常压、室温下用提取液溶解，丙酮粉以克或公斤计量，提取液以毫升或升计量，丙酮粉的质量∶提取液的体积＝1∶3～1∶5，

所述提取液为氯仿、甲醇和水的混合液，氯仿体积∶甲醇体积∶水体积＝3～5∶2～5∶1，

将丙酮粉溶液搅拌4h～5h，然后离心分离并收集上清，再将上清用低压色谱柱进行纯化，收集到的总神经节苷脂通过减压浓缩至恒重，去除其中有机溶剂；

(3)神经节苷脂GM1的MonoQ柱层析分离

将步骤(2)制备的总神经节苷脂用MonoQ柱层析分离，洗脱峰分别进行薄层层析检测，收集含有GM1的洗脱液，减压浓缩至恒重，得神经节苷脂GM1；

(4)神经节苷脂GM1的纯化

将步骤(3)所获神经节苷脂GM1用疏水柱层析分离，洗脱峰分别进行高效液相色谱检测，收集含有GM1的洗脱液，减压浓缩至恒重，获高纯度神经节苷脂GM1；

(5)神经节苷脂GM1干粉制备

将步骤(4)制备的GM1用水溶解，GM1溶液通过5万～10万截留分子量的超虑膜超虑，所得滤液经冷冻干燥制得GM1干粉，呈乳白色。

2.根据权利要求1所述的制备高纯度单唾液酸四己糖神经节苷脂的方法，其特征在于还包括总神经节苷脂的酸水解步骤，该步骤设置在神经节苷脂GM1的MonoQ柱层析分离步骤之前，操作如下：

将制备的总神经节苷脂加水溶解，总神经节苷脂的浓度控制在16g/L～20g/L，在总神经节苷脂溶液中加入盐酸，盐酸的加入量以溶液的pH＝3.0～4.0为限，在常压、室温进行酸水解，时间为2小时～3小时。

3.根据权利要求1或2所述的制备高纯度单唾液酸四己糖神经节苷脂的方法，其特征在于神经节苷脂GM1的MonoQ柱层析分离步骤中，首先对MonoQ柱进行处理，然后将4倍～5倍柱床体积的总神经节苷脂溶液或酸水解溶液以400ml/h～450ml/h流速上样，用5倍～10倍柱床体积的洗脱液A以800ml/h～1000ml/h流速进行淋洗，以5倍～10倍柱床体积的洗脱液A和洗脱液B进行梯度洗脱，

MonoQ柱处理为：将空柱装填MonoQ，以10倍～20倍柱床体积的0.4M乙酸钠-乙酸溶液淋洗并浸泡过夜，然后用10倍～20倍柱床体积的洗脱液B淋洗，再用5倍～10倍柱床体积的洗脱液A淋洗，直至基线恒定，

所述洗脱液A的配方为氯仿体积∶甲醇体积∶水体积＝4～5∶6～8∶1，洗脱液B的配方为氯仿体积∶甲醇体积∶0.4M乙酸钠-乙酸溶液体积＝4～5∶6～8∶1。

4.根据权利要求1或2所述的制备高纯度单唾液酸四己糖神经节苷脂的方法，其特征在于神经节苷脂GM1的纯化步骤是将神经节苷脂GM1溶液上样疏水柱，GM1溶液体积∶柱体积＝1∶1～3，然后用5倍～10倍柱体积的洗脱液C和洗脱液D进行梯度洗脱，

所述神经节苷脂GM1溶液的溶剂为1M乙酸钠-乙酸缓冲液，GM1的浓度为10g/L～20g/L，所述洗脱液C为1M乙酸钠-甲醇溶液，所述洗脱液D为0.005M乙酸钠-甲醇溶液。

5.根据权利要求3所述的制备高纯度单唾液酸四己糖神经节苷脂的方法，其特征在于神经节苷脂GM1的纯化步骤是将神经节苷脂GM1溶液上样疏水柱，GM1溶液体积∶柱体积＝1∶1～3，然后用5倍～10倍柱体积的洗脱液C和洗脱液D进行梯度洗脱，

所述神经节苷脂GM1溶液的溶剂为1M乙酸钠-乙酸缓冲液，GM1的浓度为10g/L～20g/L，所述洗脱液C为1M乙酸钠-甲醇溶液，所述洗脱液D为0.005M乙酸钠-甲醇溶液。