[发明专利]制备高纯度单唾液酸四己糖神经节苷脂的方法

说明书

技术领域

本发明属于单唾液酸四己糖神经节苷脂制备领域，特别涉及一种制备单唾液酸四己糖神经节苷脂的方法。

背景技术

单唾液酸四己糖神经节苷脂(monosialoganglioside，简称GM1，说明书下文和权利要求中的“GM1”即为“单唾液酸四己糖神经节苷脂”)是目前已知的唯一能穿透血脑屏障的神经节苷脂。GM1分子量为1547，主要位于髓鞘、神经元细胞膜和轴突，所以在脑内含量丰富(每克脑组织约含730nmol GM1)，外周神经如坐骨神经、股神经中也含有GM1。在中枢、外周神经受损后，内源性GM1不足，外源性GM1聚集到受损区域，整合到细胞浆膜上，通过胞吞作用成为细胞的组成成分或与膜蛋白相互作用而发挥药效。外源性GM1在临床上已用于治疗休克、缺血、缺氧、创伤引起的中枢神经系统损伤和帕金森病、老年痴呆等，并且取得了良好的治疗效果。

外源性GM1一般从哺乳动物脑组织中提取，国内外已有相关文献及专利报道。申请号为02111387.4的中国专利公开了一种制备单唾液酸四己糖神经节苷脂制剂的方法，该方法的工艺步骤为：取新鲜猪脑组织制备丙酮粉；丙酮粉加氯仿∶甲醇∶水(50∶50∶3-10，V/V/V)溶解、去沉渣，氯化钠水溶液分提上清液，下层水溶液减压去除有机溶剂，加蒸馏水后超滤膜超滤，脱盐、浓缩后冷冻干燥得混合性神经节苷脂初提物；Iatrobeads层析柱层析上述初提物，得神经节苷脂GM1初纯品，纯度75％；DEAESephadex A-25柱亲和层析或高效液相色谱方法纯化初纯品得纯化神经节苷脂GM1，纯度达95％以上，得率为猪脑湿重的0.3～0.5/1000；将纯化神经节苷脂GM1制成冻干粉针剂。此种方法的不足之处在于：1、混合性神经节苷脂初提物制备步骤的流程较复杂，该步骤中将超滤膜超滤所得滤液脱盐、浓缩后进行冷冻干燥易产生爆炸，存在安全隐患，此外，该步骤中提取液的配方有碍于增加神经节苷脂GM1的得率。2、Iatrobeads层析加DEAE Sephadex A-25柱亲和层析或高效液相色谱方法纯化，神经节苷脂GM1的纯度仅达95％以上。

申请号为00133077.2的中国专利公开了一种单唾液酸四己糖神经节苷脂的高纯度制备工艺，该工艺的步骤为：用有机溶剂混合物从哺乳动物脑组织中提取总神经节苷脂，酸水解总神经节苷脂，浓缩水解产物经脱盐后溶解于有机溶剂混合物中进行阴离子交换柱层析，收集含GM1的洗脱峰浓缩后再进行反向柱层析。此种方法虽然可得到纯度大于98％的GM1干粉，但却存在以下问题：1、提取总神经节苷脂步骤的流程较复杂。2、将浓缩水解产物经脱盐后溶解于有机溶剂混合物中进行阴离子交换柱层析，其中离子交换树脂对GM1并无选择性，而优先吸附极性小的物质，故虽然可以分离去除水溶性杂质，但同样具有亲水基团和疏水基团的磷脂则难以去除，故磷脂污染大，含磷量高。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种制备高纯度单唾液酸四己糖神经节苷脂的方法，此种方法不仅工艺流程简单、操作安全，而且可提高单唾液酸四己糖神经节苷脂的得率和避免其被磷脂污染。

本发明所述制备高纯度单唾液酸四己糖神经节苷脂的方法，工艺步骤包括：

(1)用新鲜家畜脑组织制备丙酮粉

将新鲜家畜脑组织清洗干净，加入-20℃预冷丙酮，新鲜家畜脑组织以克或公斤计量，预冷丙酮以毫升或升计量，新鲜家畜脑组织质量∶预冷丙酮体积＝1∶5～1∶10，采用4000rpm～6000rpm速度匀浆，梯度离心收集沉淀，沉淀真空干燥至恒重，得脑组织丙酮粉；

(2)制备总神经节苷脂

将步骤(1)制备的丙酮粉在常压、室温下用提取液溶解，丙酮粉以克或公斤计量，提取液以毫升或升计量，丙酮粉的质量∶提取液的体积＝1∶3～1∶5，

所述提取液为氯仿、甲醇和水的混合液，氯仿体积∶甲醇体积∶水体积＝3～5∶2～5∶1，

将丙酮粉溶液搅拌4h～5h，然后离心分离并收集上清，再将上清用低压色谱柱进行纯化，收集到的总神经节苷脂通过减压浓缩至恒重，去除其中有机溶剂；

低压色谱柱层析条件如下：将硅胶用四氯化碳-二氧六环按(四氯化碳体积∶二氧六环体积＝2∶5～1∶1)匀浆混匀后装入柱内(1×30～50cm)，然后依次用洗脱液E、洗脱液F淋洗，直至基线恒定；洗脱液E为氯仿体积∶甲醇体积＝4∶1～1∶1的氯仿-甲醇溶液，洗脱液F为氯仿体积∶甲醇体积＝5∶1～2∶1的氯仿-甲醇溶液。

(3)神经节苷脂GM1的MonoQ柱层析分离