[发明专利]一种基因打靶用中间载体及其制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地涉及一种基因打靶用中间载体及其制备方法和用途。 

背景技术

基因敲除(gene knockout)是利用同源重组(homologous recombination)技术原理，按照研究者预先设计，在小鼠整体水平上进行的可以时空调控的灭活特定靶基因的理论和技术。其广泛涉及分子生物学，分子遗传学，胚胎学，实验动物学等诸多学科领域，是目前研究基因功能最新最权威的技术平台。目前基因敲除的工作大致可分为以下几步： 

1.设计并构建预敲除的基因打靶载体(targeting vector)； 

2.将线性化的打靶载体通过电转法转入小鼠胚胎干细胞(ES细胞)； 

3.转染ES细胞的体外培养和筛选； 

4.将筛选出的中靶阳性克隆显微注射入小鼠囊胚； 

5.假孕母鼠接受囊胚移植产生出嵌合体小鼠； 

6.嵌合体小鼠再与囊胚供体小鼠杂交，即可得到杂合型的基因敲除小鼠。 

从以上实验步骤不难看出获得基因敲除小鼠的关键与基础环节是打靶载体的设计与构建，因其是否成功将直接决定基因敲除工作的进行。打靶载体是用于基因组DNA上特定位点的基因重组和突变的DNA分子构件。其基本组分是载体骨架；以及基因组DNA上打靶位点两侧的同源序列，分别称为左、右两个同源臂。考虑到DNA转染和基因打靶都是小概率事件，往往需在载体中组装正性选择标志(positive selectionmarker)来选出符合设计要求的打靶产物。正性选择标志(如对G418有抗性的Neo基因)可选择出现概率低于万分之一的稳定整合了打靶载体的转染细胞。 

目前本领域主要采用的是分步法逐步构建基因敲除打靶载体。此类方法步骤繁琐、周期长，并且在构建过程中极易出错，导致了很大的人力、物力的消耗。其大致实验步骤举例如下： 

第一步：采用PCR方法分别得到左右各3-5kb的同源臂，以及要敲除的位于两个 同源臂之间的待锚定基因外显子，然后通过TA克隆方法分别将PCR产物装入TA克隆载体从而获得待敲除目的基因组片段，经过限制性内切酶酶切鉴定和测序最终验证扩增序列的正确性(参见图1)。 

第二步：将克隆得到的左右同源臂依次装入pDNR-1r载体中两个loxp位点两侧，然后将要敲除的基因或基因外显子装入两个loxp位点之间(如下图)。由于两个loxp位点之间含有一个四环素抗性基因，两个loxp位点外侧多克隆位点很少，所以，这一步是该种方法的关键，也是最困难的一部分，往往需要花费很长的时间。如果找不到合适的多克隆位点，构建打靶载体以及后面的同源重组将无法实现(参见图2)。 

第三步：将pk-11载体中的阳性筛选基因装入第二步中构建的带左右同源臂的载体，并最终获得带阳性筛选标记，敲除基因外显子和两端同源臂的打靶载体(参见图3)。 

通过以上介绍，可知因为载体以及载体的多克隆位点的限制加上PCR的不确定性，采用现有方法构建基因敲除打靶载体步骤复杂，耗时长。一般情况下，采用现有方法构建打靶载体需要进行反复的扩增、TA克隆、限制性内切酶酶切验证和测序，花费大量的时间和经费。 

因为构建打靶载体成功与否将直接关系到建立基因敲除小鼠工作的顺利进行，为了加快速度，节省更多的人力物力财力，进一步缩短获得基因敲除老鼠的实验周期，本领域需要建立能克服现有技术的缺陷的新技术。 

发明内容

为了使建立基因敲除打靶载体的工作速度更快，成本更低，成功率更高，本发明提供了一种的基因打靶用中间载体。 

本发明所要解决的第一个技术问题是提供了一种基因打靶用中间载体。该载体含有两个loxp位点序列和两端各连接一个frt位点序列的阳性筛选基因。两端各连接了一个frt位点序列的阳性筛选基因既可以位于两个loxp位点的上游，业可以位于其下游。 

其中，上述的两个loxp位点序列之间还有一多克隆位点(MCS)。该多克隆位点可以根据需要打靶的基因序列在现有的多克隆位点中进行选择。优选的，该多克隆位点具有SEQ ID No.4所示的序列。 

其中，上述的阳性筛选基因也可以在现有的基因打靶常用的阳性筛选基因中选择。优选的，上述阳性筛选基因为pgkNEO基因。 

进一步的，上述的基因打靶用中间载体还含有抗性筛选基因的序列。上述的抗性筛选基因也可以在本领域常用的抗性筛选基因中选择。优选的，上述抗性筛选基因为AMP^r、kan、chl、tet或neo中的至少一种。