[发明专利]红薯生淀粉水解发酵的复合水解酶制备方法

说明书

技术领域：一种红薯生淀粉水解发酵的复合水解酶制备方法，用于红薯生淀粉水解发酵的复合水解酶制备。涉及一种能对红薯生淀粉原料进行常温水解，并能实现生料水解发酵同步过程的复合水解酶的制备技术领域。

技术背景：现有技术中，常规酒精生产是采用双酶水解法，即先用α-淀粉酶将淀粉原料在高温下水解，将淀粉变成短链糊精、麦芽糖等，然后再用糖化酶水解成可发酵用的葡萄糖，其缺点是：流程复杂，需升温、降温等过程，能耗高，其中的糖化酶目前在国内外主要由嗜温真菌生产，需要的温度较高，一般在50～60℃之间，偏离最适温度范围，其酶的活力会大大降低；另一方面，用嗜温真菌发酵生产的糖化酶，普遍存在杂菌的污染，使糖化酶的应用，尤其在生淀粉原料一步法酒精生产中的应用受到很大的限制；为了提高酶水解生淀粉的效果，也有以糖化酶为主，再加以α-淀粉酶、果胶酶、纤维素酶、酸性蛋白酶、脱枝酶、植酸酶等的研究，但是由于各种酶的最适温度和最适pH存在的差异性，导致其水解生淀粉的效果并不理想；由于普通的糖化酶没有生淀粉的吸附位点，对生淀粉没有水解能力或其水解能力很差，尽管目前国内外有一些对生淀粉具有水解能力的糖化酶，但由于其对生淀粉的吸附力的问题、或由于其作用的最适温度较高的问题，使其对生淀粉的水解，尤其是常温下对生淀粉的水解效率较低，从而导致目前生淀粉原料一步法酒精生产的周期很长、效率很低。

发明内容：本发明针对现有技术的不足，采用先筛选出发黑曲霉3L-0菌株，再获取3L-1产酶菌株，最后获得复合水解酶，发明了一种能在常温下对生淀粉原料进行高效水解，并能实现生料水解发酵同步过程的红薯生淀粉水解发酵的复合水解酶制备方法。

本发明是这样实现的：首先借助基因工程技术对经筛选的出发黑曲霉3L-0菌株进行定点诱变和遗传育种，获得含有多拷贝的糖化酶基因的优良特种3L-1产霉菌株，然后将该菌株培养发酵，经过对发酵液进行分离、真空浓缩和对酶进行吸附、沉淀、真空干燥等操作，得到对生料淀粉具有很强的水解能力的高效糖化酶，且酶活力强不易失活，其作用的最适温度为25～45℃；最适pH值为3～5.5，然后以该糖化酶为主，将其与其它酶复配成为生料水解发酵同步过程的复合水解酶；由于其能在常温下高效快速水解生淀粉，该复合水解酶可用于水解与发酵同步的生料一步法酒精生产工艺，另外，利用3L-1产霉菌株生产糖化酶时可在较高温度下进行，在后面复合酶的制备中又是在较清洁的环境中进行，因此得到的复合水解酶中杂菌污染少，这在生淀粉原料一步法酒精生产中杂菌污染的控制方面有积极的作用；

本发明包括以下工艺：

第一步：筛选出发黑曲霉3L-0菌株：从大生产中挑选出发酵单位高于10000u/mL的保藏黑曲霉菌株10株，先用筛选培养基进行平板涂布筛选，然后摇瓶筛选，得到出发黑曲霉3L-0菌株；

第二步获取3L-1产酶菌株：对获得的出发黑曲霉3L-0菌株进行定点诱变和遗传育种，获得含有多拷贝糖化酶基因的3L-1产霉菌株；

第三步用3L-1产酶菌株发酵制糖化酶：先将获得的3L-1产霉菌株经斜面菌种培养获得斜面菌种，然后接种于由红薯淀粉原料制成的种子培养基中，在30～40℃下，培养30～60小时，获得种子；在将种子接入由红薯淀粉原料制成的发酵培养基中，在30～40℃，通气培养100～120小时的培养，获得发酵产物；最后将发酵产物离心分离、真空浓缩、拌料吸附、乙醇沉淀，在50～60℃下真空干燥，获得能够高效水解生料的糖化酶产品；

第四步复合水解酶的制备：先取获得的60～80％的糖化酶产品，加入15～25％低温酸性α-淀粉酶、1～5％果胶酶、1～5％纤维素酶、1～5％脱枝酶进行组合；然后将配好的组合在常温下用搅拌器低速混合5～10分钟，也可以是在常温下用乳钵轻柔混合20～30分钟，最后将其密封包装。

本发明的优点和有益效果是：实现了常温下生料淀粉糖化水解与发酵的同步过程，制备的复合水解酶具有水解能力强、速度快的特点，从而可使发酵时间缩短，并可实现浓醪发酵，因此过程的能耗低、生产效率高；利用3L-1菌株生产糖化酶可在较高温度下进行，而在后面复合酶的制备中又是在较清洁的环境中进行，因此具有杂菌少，能减少发酵过程中的杂菌污染的优点；本发明利用酶活力强不易失活的特点，在固液分离后还能对醪渣中的少量残余淀粉继续进行水解，结合醪渣固态深层发酵产酒，可使淀粉利用率最终达到95％以上。

具体实施方式：下面结合附图对本发明进一步说明：本发明包括以下工艺：