[发明专利]一步法构建阳离子化载体蛋白与黄曲霉毒素B1的偶联物

权利要求书

1.阳离子蛋白，其特征在于结构式：

其中，载体蛋白的羧基几乎全部被胺乙基取代，整个蛋白带正电，因而作为完全抗原免疫动物时，阳离子载体蛋白更易与机体内带弱负电的细胞膜表面结合，进而被抗原提呈细胞识别和刺激机体内的免疫应答。

2.AFB₁-阳离子蛋白偶联物，其特征在于它的分子结构式为：

其中，载体蛋白可以是阳离子牛血清白蛋白(Cationized bovine serum albumin，cBSA)、阳离子卵清白蛋白(Cationized ovalbumin，cOVA)、阳离子辣根过氧化物酶(Cationizedhorseradish peroxidase，cHRP)、阳离子血孔匙蛋白(Cationized keyhole limpet hemocyanin，cKLH)或阳离子多聚赖氨酸(Cationized ploy-L-lysine，cPLL)，分别与AFB₁结合得到AFB₁-cBSA、AFB₁-cOVA、AFB₁-cHRP、AFB₁-cKLH和AFB₁-cPLL。

3.制备权利要求1所述一种阳离子载体蛋白的方法，其特征在于包括步骤：

(1)制备cBSA，步骤如下：

将20～100μL乙二胺(ethylenediamine，EDA)加入到冰浴的500μL 0.1mol/L 2-乙烷磺酸(2-(N-morpholino)ethane sulfonic acid，MES)缓冲液中，并用1mol/L HCl将pH调节到4～6，然后，将5～100mg BSA溶解在50μL的上述MES缓冲液后，与上述EDA溶液混匀，再在上述混合液中添加2～50mg的碳化亚二胺(1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide，EDC)，室温搅拌1～12h，用4mol/L的醋酸终止反应，用去离子水充分透析48～72h后，将其冻藏备用。

(2)制备cOVA，步骤如下：

将20～100μL EDA加入到冰浴的500μL 0.1mol/L MES缓冲液中，并用1mol/L HCl将pH调节到4～6，然后，将5～100mg OVA溶解在100μL的上述MES缓冲液后，与上述EDA溶液混匀，再在上述混合液中添加2～50mg的EDC，室温搅拌1～12h，用4mol/L的醋酸终止反应，用去离子水充分透析48～72h后，将其冻藏备用。

(3)制备cHRP，步骤如下：

将20～100μL EDA加入到冰浴的500μL 0.1mol/L MES缓冲液中，并用1mol/L HCl将pH调节到4～6，然后，将5～100mg HRP溶解在500μL的上述MES缓冲液后，与上述EDA溶液混匀，再在上述混合液中添加2～50mg的EDC，室温搅拌1～12h，用4mol/L的醋酸终止反应，用去离子水充分透析48～72h后，冻藏备用。

(4)制备cKLH，步骤如下：

将20～100μL EDA加入到冰浴的500μL 0.1mol/L MES缓冲液中，并用1mol/L HCl将pH调节到4～6，再将5～100mg KLH溶解于800μL的上述MES缓冲液后，与上述EDA溶液混匀，再在上述混合液中添加2～50mg的EDC，室温搅拌1～12h后，用4mol/L的醋酸终止反应，用去离子水充分透析48～72h后，冻藏备用。

(5)制备cPLL，步骤如下：

将20～100μL EDA加入到冰浴的500μL 0.1mol/L MES缓冲液中，并用1mol/L HCl将pH调节到4～6，再将5～100mg PLL溶解于1000μL的上述MES缓冲液，然后，与上述EDA溶液混匀，再在上述混合液中添加2～50mg的EDC，室温搅拌1～12h后，用4mol/L的醋酸终止反应，最后用去离子水充分透析48～72h，冻藏备用。

所用EDA体积在20μL～100μL之间，所用的载体蛋白质量在5mg～100mg之间，EDA与MES的体积比在1∶25～1∶5之间，MES缓冲液的pH调节到4～6。