[发明专利]一步法构建阳离子化载体蛋白与黄曲霉毒素B1的偶联物

说明书

技术领域

本发明涉及阳离子载体蛋白的制备及黄曲霉毒素B₁-阳离子蛋白偶联物的一步法构建。将构建的偶联物作为免疫原免疫动物，可提高机体的免疫应答水平，制备高质量的抗黄曲霉毒素B₁抗体。

背景技术

黄曲霉毒素(Aflatoxin，AFT)是一类主要由寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)和产毒的黄曲霉(A.flavus)所产生的有毒次生代谢产物，其中以黄曲霉毒素B₁(aflatoxin B₁，AFB₁)的危害最大，是目前已知的毒性最大的致癌物之一。国际癌症研究机构已将其列为I级致癌物。由于AFB₁污染食品的途径很多，因此要完全杜绝AFB₁的污染是不可能的，完善监督措施和采用科学检测方法可以在最大程度上减少AFB₁对人类健康的危害。目前AFB₁的检测方法主要有基于理化和免疫的分析方法，前者包括薄层层析法、高效液相色谱、质谱和毛细管电泳等，薄层层析法作为我国目前检测AFB₁国标方法，虽然操作简便，成本低廉，但由于是半定量方法，灵敏度低，已经难以满足低检测限的需要；而其他仪器分析方法虽然灵敏度高、重现性好，但同时存在着耗时、检测仪器昂贵、操作复杂等缺点，不能满足现场快速检测的需求；而酶联免疫吸附反应、免疫微柱以及免疫芯片等免疫学检测方法由于节省时间、成本低、操作简便，适合批量检测和现场检测，正逐步受到我国各质检相关部门的重视。

AFB₁作为半抗原，需将其与载体蛋白偶联后，才能具备刺激动物产生抗体的免疫原性。但由于完全抗原制备过程复杂，AFB₁利用率低，因此常常需要使用较大量的AFB₁才能制备得到相应的抗体；然而，“9.11”事件后，AFB₁作为一种剧毒的生物试剂被美国等发达国家严格控制。市场上该毒素标准品不仅价格高而且难以买到，这给研究AFB₁的免疫学检测方法带来很大困难，也在一定程度上阻碍了免疫学方法的应用和推广。

早期研究认为AFB₁本身性质不活泼，不具备与载体蛋白连接的活性基团，需将其衍生后，再与载体蛋白偶联，即先将AFB₁转化为AFB₁-羧基活化物(AFB₁-Oxime，AFB₁-O)，然后，在碳化二亚胺(1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide，EDC)等偶联剂的催化下，与载体蛋白发生缩合反应，形成稳定的AFB₁-O-载体蛋白偶联物。其中，第一步AFB₁的转化率为70％～80％，AFB₁-O的纯化得率为80％～90％，而第二步，仅有30％～40％的AFB₁-O偶联到载体蛋白上。因此，AFB₁的总利用率在20％左右，利用率较低。

综合上述原因，研究提高AFB₁利用率的偶联物制备方法是非常必要的。

本发明利用了阳离子载体蛋白胺甲基化原理构建了AFB₁-阳离子载体蛋白的偶联物。在AFB₁的结构中，由于其羰基的α-活泼氢在弱酸条件下，以烯醇式存在，可通过甲醛的偶联作用，与载体蛋白的胺乙基发生胺甲基化偶联。由于阳离子载体蛋白的羧基几乎全部被胺乙基取代，因而整个蛋白带正电，作为完全抗原免疫动物时，较之普通蛋白的偶联物，阳离子载体蛋白更易与机体内带弱负电的细胞膜表面结合，进而被抗原提呈细胞识别和刺激机体内的免疫应答，同时，也提高了机体对共价偶联在阳离子载体蛋白半抗原(AFB₁)的识别和应答水平，即可刺激抗原提呈细胞对半抗原决定簇的提呈、促进T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖。

本发明中AFB₁的总利用率在50％左右。实验证明，通过该法制备的偶联物具有较好的免疫原性，能够刺激机体产生高质量的AFB₁抗体。因此，本发明相对于传统合成方法，有操作步骤少、毒素利用率高、抗体效价高等优点。

本专利发明者针对两步法存在的诸多问题，发明了用阳离子载体蛋白一步构建黄曲霉毒素B₁-载体蛋白偶联物的方法。相关研究国内外尚未见报道。

主要参考文献