[发明专利]一种DNA的多点定向突变方法

权利要求书

1、一种DNA分子多点定向突变的方法，包括重叠延伸PCR步骤，其特征在于，在所述的重叠延伸PCR之前增加一个单向PCR步骤：即在期望的基因突变位点处设计一对特异引物，每一条特异引物先进行单向PCR，按照编号为P1与P4，P3与P6，P5与P8，P7与P2的组合将单向PCR产物合并后，进行第一轮PCR，产物为含有不同突变位点的DNA片段；以第一轮PCR产物为模板，进行第二轮PCR；再以第二轮PCR产物为模板，进行第三轮PCR，得到全长基因序列。

2、根据权利要求1所述的方法，其中的特异引物P3、P4、P5、P6、P7和P8的序列如下所示，

P3：5’-ctctttc ttcaagagcg ctttagccgc cgct-3’；

P4：5’-aaag cgctcttgaa gaaagagctt ctcgctg-3’；

P5：5’-gag ttagtcaagt tgcttttgaa agaggatc-3’；

P6：5’-caaaagca acttgactaa ctcaatatca tcc-3’；

P7：5’-aattag gaaattcgtc cctgacagat tcgacttctt ccacatcga-3’；

P8：5’-tctgtcagg gacgaatttc ctaattccaa attgtcctca ctaaag-3’。

3、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的单向PCR步骤如下：

1)反应体系：在25ul PCR反应液中，含有30ng模板DNA，2.5ul PCR缓冲液，1ul 25mM MgSO4，2.5ul 2mM dNTPs，1.5ul 10pmol/ul特异引物，0.5U KOD-Plus；

2)扩增条件：94℃ 2min；94℃ 15sec，55℃ 30sec，68℃ 1min，共5个循环。

4、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，第一轮PCR的扩增条件是：94℃ 2min；94℃ 15sec，55℃ 30sec，68℃ 1min，30个循环，后延伸68℃ 5min并回收PCR产物。

5、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，第二、三轮PCR的模板是将回收后的产物稀释100倍使用。

6、权利要求1所述的方法在基因定向诱变中的应用。