[发明专利]一种DNA的多点定向突变方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地说涉及一种DNA的多点定向突变方法，与基因体外诱变技术有关。

背景技术

基因诱变是改造生物体最直接有效的方法，它的发展经过了从整体(细胞)诱变到局部(基因)诱变，从体内的随机诱变到体外的定点诱变。体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具，也是改造、优化基因常用的手段。该技术的潜在应用领域很广，如研究蛋白质相互作用位点的结构、改造酶的不同活性或者动力学特性，改造启动子或者DNA作用元件，提高蛋白的抗原性或者是稳定性、活性，研究蛋白的晶体结构，以及药物研发、基因治疗等方面。对于单一位点的突变，常采用的方法是寡核苷酸介导的定点突变、盒式诱变以及PCR介导的定点突变(罗师平，冷希冈.基于PCR的体外诱变技术.国外医学生物医学工程分册，2005，3：188-192.)。PCR介导的定点突变技术由于其快速、简便、准确等优点，得到了广泛的应用，其主要方法包括重叠延伸PCR介导的定点突变以及环状诱变PCR。而对于多位点的定向突变，目前主要采用多位点的环状诱变PCR，其优点是无需亚克隆，但由于其要扩增整个质粒，因而需要保真度好且扩增效率高的DNA聚合酶，并且同时引入多个突变的效率并不高(如Stratagene公司推出的QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis kit，其同时引入3个定点突变的效率为60％，5个定点突变的效率为30％)。本发明通过改进重叠延伸PCR的反应条件，提高了同时引进多点突变的频率，为体外多点定向突变提供了一种简单高效的方法。

发明内容

本发明的目的是提高同时引入多点突变的频率。以重叠延伸PCR为基础，通过改进引物设计方法，优化PCR反应条件，成倍提高了同时引入多点突变的频率，为在实验室进行体外多点定向突变操作提供了一种经济有效的方法。

本发明通过以下方式实现：

在任何一个基因的两端各设计一条包含酶切位点的引物，在需突变的位点设计一对特异引物。在第一轮PCR之前，先进行特异引物的单向PCR，再经过多轮PCR过程，得到全长基因并克隆测序。其具体步骤如下：

1、引物设计

根据需突变位点序列，设计一对特异引物，其中，引物中的突变位点5’端为10个碱基，3’端为20个碱基左右，因此同一突变位点的一对引物之间重叠序列为21个碱基。引物设计如附图1所示。

2、第一轮PCR

此轮PCR分为单向PCR与常规PCR两个阶段：

单向PCR：

1)反应体系：在25ul PCR反应液中，含有30ng模板DNA，2.5ul PCR缓冲液(购自TOYOBO，下同)，1ul 25mM MgSO₄，2.5ul 2mM dNTPs，1.5ul 10pmol/ul引物，0.5U KOD-Plus(TOYOBO)；

2)反应程序：94℃ 2min；94℃ 15sec，55℃ 30sec，68℃ 1min，5个循环。

常规PCR：

1)反应体系：按P1和P4、P3和P6、P5和P8、P7和P2的组合，将单向PCR反应产物加在一起；

2)反应程序：94℃ 2min；94℃ 15sec，55℃ 30sec，68℃ 1min，30个循环；及后延伸68℃ 5min；

3)分别回收PCR产物P1P4、P3P6、P5P8、P7P2。

3、第二轮PCR

将第一轮PCR反应的产物稀释100倍作为此轮PCR反应的模板，按照P1P4、P3P6(引物P1和P6)与P5P8、P7P2(引物P5和P8)的组合进行。

1)反应体系：在50ul PCR反应液中，含有两种模板DNA各1ul，5ul PCR缓冲液，2ul 25mM MgSO₄，5ul 2mM dNTPs，1.5ul 10pmol/ul引物1，1.5ul 10pmol/ul引物2，1U KOD-Plus(TOYOBO)；

2)反应程序：94℃ 2min；94℃ 15sec，55℃ 30sec，68℃ 1min，35个循环；及后延伸68℃ 5min；

3)回收PCR产物P1P6、P5P2。

3、第三轮PCR

将第二轮PCR反应产物稀释100倍作为此轮PCR反应的模板。