[发明专利]一种适用于1型鸭肝炎病毒抗体乳胶凝集检测试剂盒及应用

说明书

技术领域

本发明属于禽类免疫学技术领域，具体地，本发明涉及一种适用于1型鸭肝炎病毒抗体乳胶凝集试剂盒的研制及其在1型鸭肝炎病毒抗体检测中的应用。

背景技术

鸭病毒性肝炎(Duck virus Hepatitis，简称DVH)是由鸭肝炎病毒(Duck Hepatitis virus，简称DHV)引起的雏鸭高度致死、高度传播性的病毒性传染病。临床上以具有明显神经症状和肝脏肿大、表面呈斑点样出血为特征。其主要侵害6周龄以内雏鸭，尤以2日至3周的雏鸭最为易感，成年鸭有抵抗力。不同日龄的雏鸭发病后，死亡率有所不同，有的高达95％，有的低于15％。耐过的鸭成为僵鸭，生长和发育受到障碍严重影响经济效益。1945年Levinl最先在美国发现DVH，其后，在英国、加拿大、德国、意大利、印度、法国陆续地报道了本病流行情况。我国黄均建等首次报道了上海某鸭场于1958年秋至1962年春本病的暴发和流行情况，次后，全国各地都相继报道了本病的爆发与流行。鸭肝炎病毒有1型、2型和3型3个血清型，1型DHV呈世界分布，2型DHV局限于英格兰，3型主要局限于美国。近年来，随着我国养鸭业的规模化发展，虽对种鸭、雏鸭进行了免疫预防，但DVH仍然时有发生，并常与病毒、细菌混合感染，给临床诊断与防制带来了很大的困难。在疾病爆发时，雏鸭的死亡速度惊人。对本病最有效的防制方法是用DHV-1疫苗免疫种鸭，使后代雏鸭获得高水平的母源抗体从而达到被动免疫的目的。另外，雏鸭在1日龄免疫弱毒疫苗，3～7d可产生免疫力，但母源抗体可影响免疫效果，所以在免疫前应对雏鸭母源抗体水平进行检测，否则可能导致免疫失败。建立1型鸭肝炎抗体的血清学检测方法，了解鸭病毒性肝炎抗体的消长和转移情况有利于制定有效的免疫程序。

目前，检测1型鸭肝炎病毒抗体方法主要有中和试验(SN)、琼脂扩散试验(AGP)、免疫荧光试验( IF)和酶联免疫吸附试验(ELISA)等。中和试验是检测1型鸭肝炎病毒抗体最根本、最经典的方法也是国家标准方法，但该方法比较烦琐，需要很有经验的人员来操作，而且存在着固有的一些不足之处，比如操作繁琐、需时长，存在生物安全性等问题，不适合基层推广。琼脂扩散和免疫荧光试验在敏感性和特异性方面都不尽人意，且田间样本复杂多变，干扰大，使得这些方法在临床检测中的应用受到一定限制。ELISA虽然相对容易一些，但仍然需要一定的仪器设备和操作技能需要时间也较长(3-5小时)。乳胶凝集试验(Latex Aagglutination Test，简称LAT)由于其迅速(3分钟)、简单和无须专门的技能和任何特殊仪器设备而具有巨大的优势。

提纯病毒的方法很多(殷震等编著：《动物病毒学》，科学出版社)，但不同的病毒，由于结构及理化特征不同，其最适提纯方法不同。在鸭肝炎病毒的提纯方面，众多的学者通过不同的方法进行提纯，但是众说纷纭，一直以来没有一种公认的可重复性强的方法。目前由于病原病毒提纯困难，难以获得高浓度高纯度的病毒，使得应用于临床的诊断一直存在发展瓶颈。蒋文灿等，用六种方法提纯1型DHVSC株，电镜观察比较了提纯结果。以“氯仿去脂一硫酸铵沉淀一蔗糖密度梯度离心法”最佳。(蒋文灿，廖德惠，谢镜怀.雏鸭病毒性肝炎的研究[J].中国兽医杂志，1989，15(1)：9-11.)然而，1990年罗函禄等亦采用此种方法纯化病毒并用电镜观察确定病毒纯化程度，所得结果与蒋文灿等不一致，病毒粒子大小极不均一，可能是硫酸铵沉淀破坏了病毒的形态结构。且病毒在蔗糖中的浮密度为30％，可能是离心力不同所致。而且蔗糖较难达到完全脱糖从而易滋生细菌，影响灭活病毒液在较高温度下的保存期。而罗函禄等所采用的30％聚乙二醇(PEG)反透析法及II一DEAE纤维素色谱法取得了较好的提纯效果(罗函禄，徐汗祥，范文明等.鸭病毒性肝炎的研究[J].中国畜禽传染病，1990，(3)：1-3.)。但是，采用的30％聚乙二醇(PEG)反透析法及II一DEAE纤维素色谱法均操作较繁琐，且稳定性差，病毒损耗大等缺点不适合生产化大量纯化病毒。赵新柳(ELISA检测鸭病毒性肝炎抗体的研究[J]，中国兽医科技，1990，(11)：5-6)  曾提出差速超高速离心效果较好。因而，本申请人在此基础上作出进一步的改进，提高最超离速度增加病毒收集量，同时摸索出合适的离心速度组合，提高病毒的纯度。此法具有操作简单，稳定性好，病毒纯度高的特点。