[发明专利]植物中外源基因的瞬时表达方法

说明书

技术领域

本发明为一种植物中外源基因的表达方法，具体涉及一种根部吸收法。

背景技术

近年来，随着利用植物来表达外源蛋白的发展，许多研究者开始了在植物中利用病毒载体来进行瞬时表达外源基因，其实用价值和开发前景已获得普遍的肯定。利用植物生产的一些药用蛋白，疫苗，抗体等已经用于临床实践阶段，利用植物生产外源蛋白越来越显出其重要意义。目前，人们普遍使用叶片注射法来进行外源基因的瞬时表达，其缺点是难以实现规模化生产，从而影响了其在生产上的推广应用。

在过去的二十年中，大量研究表明植物能够有效表达许多外源蛋白，包括人的血清蛋白，生长因子，抗体，疫苗等。利用植物生产外源蛋白主要有两种方式，即稳定表达和瞬时表达。瞬时表达具有快速，安全，有效等优点，因此，近些年来逐渐成为国内外的研究热点。几个植物病毒载体已经被发展为能够成功表达外源蛋白的载体，包括烟草花叶病毒，马铃薯X病毒，烟草脆裂病毒(TMV，PVX和TRV)等。

现在普遍用于瞬时表达外源蛋白的方法有叶片注射法和真空吸收法，但这两种方法都有其局限性，难以实现规模化生产。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物中外源基因的瞬时表达方法

实验材料：

植物材料：包括烟草Nb或Nb-Hc-Pro基因型，Nb-Hc-Pro为表达转录后基因沉默抑制子Hc-Pro的转基因烟草植物。将Nb或Nb-Hc-Pro的种子播种于1/2MS培养基(网上查得)，放于光照培养箱，培养一周左右。将小苗移栽于花盆中，在25±3℃的温度条件下，每天日光或灯光照射16h和黑暗8h的循环条件下进行培养，生长28-35天左右，分别选取处于四叶期，五叶期和六叶期的小苗作为侵染材料。

载体和菌种：

原始载体p35S-30B-GFP(如图1)由中国科学院微生物研究所植物生物技术实验室公开提供，EHA105-30B-GFP载体由本实验室以常规方法构建。农杆菌EHA105由本实验室储备(可以在市场购买到)。绿色荧光蛋白(GFP)纯化蛋白可以在市场购买到。兔源绿色荧光蛋白(GFP)抗体购买于宝生物公司。

农杆菌侵染液：

将农杆菌EHA₁₀₅-30B-GFP放于5ml LB中(添加5μl的50μg/ml卡那霉素，5μl的50μg/ml利福平，5μl的5μg/ml四环素)，28℃条件下过夜培养，，然后将1ml过夜的培养物按照1∶50的比例进行扩摇(280r/min)。50mlLB中加入以上抗生素各50ul后，添加Mes10mol/L(PH5.6)和AS 20mol/L。28℃条件下过夜，农杆菌培养液在3000r/min，4℃条件下离心收集菌体，然后重悬于重悬液MMA(10mmol/LMgCl₂，10mmol/LMes，100μmol/LAS。分别选择重悬液MMA OD₆₀₀为0.58，0.82，1.05，1.25，1.41或1.62的浓度进行侵染，在侵染前静置3h。

实验方法：

根部吸收法：

取4-5ml的农杆菌EHA₁₀₅-30B-GFP重悬液，盛放于5ml离心管中，然后分别将四叶期，五叶期和六叶期的带根小苗的根部直接放入重悬液中，最后将浸染材料在室温28℃，日光、灯光照射16h或黑暗8h中培养，并在紫外灯照射条件下进行连续一周的观察并拍照。对表达绿色荧光蛋白(GFP)的植株分别提取植物总RNA和总可溶性蛋白，进行RT-PCR水平和蛋白水平(Western-Blot)上的检测。

本发明具有操作过程简单，容易规模化，具有较高的表达水平等优点。将有利于在植物中进行药用蛋白的大规模的生产、推广和应用。

附图说明

附图1为p35S-30B-GFP载体图；

附图2为不同菌液浓度对表达效率影响的示意图；

附图3为不同苗龄的小苗对表达效率影响的示意图；

附图4为干旱处理对表达效率影响的示意图

具体实施方式

实例一：