[发明专利]一种具有纤维素酶活性的粟酒裂殖酵母工程菌及其构建方法

权利要求书

1.一种具有纤维素酶活性的粟酒裂殖酵母工程菌，是将构建的含有纤维素酶基因的重组粟酒裂殖酵母表达载体导入粟酒裂殖酵母中得到的。

2.根据权利要求1所述粟酒裂殖酵母工程菌，其构建方法是将纤维素酶基因插入到粟酒裂殖酵母表达载体的多克隆位点处，将构建的重组粟酒裂殖酵母表达质粒导入粟酒裂殖酵母中，获得重组粟酒裂殖酵母转化子，培养重组粟酒裂殖酵母使防御素基因得到分泌表达。

3.根据权利要求1、2所述重组粟酒裂殖酵母表达载体，其特征在于：该载体是含有Pnmt1启动子、纤维素酶基因、Pnmt1终止子序列、以及筛选标志的重组粟酒裂殖酵母表达载体。

4.根据权利要求3所述载体，其特征在于：所述的纤维素酶基因为纤维二糖水解酶基因(CBHII)/葡聚糖内切酶基因(EGI)/β-葡萄糖苷酶(BGLI)。

5.根据权利要求1、2、3和4所述，纤维酶CBHII/EGI基因位于粟酒裂殖酵母表达载体pESP-2的多克隆位点处的NheI和BglII限制性内切酶酶切位点之间，构建的重组粟酒裂殖酵母表达载体为pESP-2-CBHII/pESP-2-EGI，获得的重组粟酒裂殖酵母工程菌为SP-Q01/pESP-2-CBHII/SP-Q01/pESP-2-EGI，所述纤维素酶BGLI基因位于粟酒裂殖酵母表达载体pESPUC的多克隆位点处的XhoI和NotI限制性酶酶内切位点之间，构建的重组粟酒裂殖酵母表达载体为pESPUC-BGLI，获得的重组粟酒裂殖酵母菌株为SP-Q01/pESPUC-BGLI。

6.根据权利要求1、2、3、4和5所述的载体，其特征在于：所述筛选标志有两种，一种为氨苄青霉素抗性基因(ampicillin resistance Amp⁺)，其允许在大肠杆菌(E.coli)克隆时进行载体的复制和抗生素选择；一种为选择标记基因LEU2-d，源自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiea)可以作为向粟酒裂殖酵母(S.pombe)细胞中转化表达结构的选择标定物亮氨酸。

7.根据权利要求2所述的纤维素酶基因表达的方法，其特征在于：是将构建的含有纤维素酶基因的重组粟酒裂殖酵母表达载体的质粒DNA，采用醋酸锂法和电穿孔法导入粟酒裂殖酵母SP-Q01中，获得重组粟酒裂殖酵母转化子，培养重组粟酒裂殖酵母转化子使纤维素酶基因得到分泌表达。

8.根据权利要求7所述的纤维素酶基因表达的方法，其特征在于：重组粟酒裂殖酵母在表达纤维素酶基因无须加入诱导物，纤维素酶基因前端自带的信号肽序列可使纤维素酶基因获得分泌表达，表达时间为2～6天。