[发明专利]一种具有纤维素酶活性的粟酒裂殖酵母工程菌及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种具有纤维素酶活性的粟酒裂殖酵母工程菌及其构建方法。

背景技术

纤维素酶的酶学研究开始于1912年，直到1954年才由美国人Reese提出了Cl-CX概念，此后的研究证明：纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，它往往不是单种酶，包括多种水解酶成员，构成了一个复杂的纤维素酶家族。目前普遍认为，完全降解纤维素至少需要由三种功能不同但又互补的纤维素酶。

(1)葡聚糖内切酶(endo-1，4-β-D-glucanase，EC 3.2.1.4，来自真菌简称EG，来自细菌简称Len)，又称为C1酶，这类酶作用于纤维素内部的非结晶区，随机水解β-1，4-糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量带非还原性末端的小分子纤维素。木霉的EG主要包括EGI、EGIII和EGV，EGI是木霉的主要内切葡聚糖酶，葡聚糖内切酶分子量介于23～146kD之间，如EGI为54kD，EGIII约为49.8kD。

(2)葡聚糖外切酶(exo-1，4-β-D-glucanase，EC 3.2.1.91，来自真菌简称CBH，来自细菌简称Cex)，又称为Cx酶，这类酶作用于纤维素线状分子末端，水解1，4-β-D糖苷键，每次切下一个纤维二糖分子，故又称为纤维二糖水解酶(Cellobiohydrolase简称CBH)，CBH是木霉的主要纤维素酶，已知有两种同功酶CBHI和CBHII，其中CBHII起主要作用。外切酶的分子量介于38～118kD之间，CBHI分子量约为66kD，CBHII约为53kD。

(3)β-葡萄糖苷酶(β-Glucosidase，EC 3.2.1.21，简称BGL)这类酶一般将纤维二糖或纤维寡糖水解成葡萄糖分子，一般不直接作用于纤维素分子，包括BGLI和BGLII两种同功酶，木霉产生的BGL量较少，β-葡萄糖苷酶分子量约为76kD。

纤维素酶的大规模工业化应用在很大程度上受纤维素酶酶活较低以及成本较高的限制，同时纤维素酶是诱导酶，在同时存在葡萄糖等物质存在时，纤维素酶的合成受到阻遏，因此人们把大量的精力投入到选育优良的纤维素酶工程菌上，希望能找到酶的合成不受降解产物阻遏、酶蛋白组成型表达、酶组分比例协调、产酶能力强、酶活性高、无毒性嫌疑的菌种。随着以分子克隆为基础的基因重组技术的快速发展，国内外的研究者已开始应用重组DNA技术对纤维素酶产生菌进行改造或创造新的纤维素酶产生菌。纤维素酶基因克隆为研究纤维素酶的生物合成和作用机制以及了解纤维素酶遗传特性进而构建高效纤维素分解菌开辟了新途径，最有可能使纤维素的分解利用问题取得突破性进展。国内外在这方面展开了大量的研究，研究的领域不断扩大，取得了许多进展。纤维素酶基因克隆研究主要集中在酸性纤维素酶方面，起始于70年代，发展非常迅速。真菌主要产酸性纤维素酶，近十几年来，人们对真菌木霉属纤维素酶基因做了大量的研究。绿色木霉(Trichoderma viride)所产生的纤维素酶的降解作用日益受到重视，国内外对这方面的研究也日益增多。南非科学家Wyk JP.H和Mohulatsi M指出，绿色木霉所产生的纤维素酶可将废报纸中的纤维素转化为可发酵的糖，不仅减少了环境污染，还对废报纸进行了回收利用。但其所产生的纤维酶的生物转化尚未扩展到工业规模，原因是纤维素酶的量和活性都较低。随着转基因技术的不断成熟，绿色木霉纤维素酶基因在基因工程上的应用，逐渐引起人们的关注。