[发明专利]狂犬病毒套式RT－PCR检测方法及检测试剂盒

权利要求书

1.一种狂犬病毒套式RT-PCR检测方法，其特征是：将RT-PCR检测的样品进行预处理后，提取总RNA，并以狂犬病病毒ERA株的细胞培养物作为RT阳性对照样品，未接毒细胞培养物作为阴性对照样品，与待检样品同时进行总RNA的提取操作；通过套式RT-PCR反应获得特异性扩增产物，将狂犬病毒SRV9细胞毒的总RNA的反转录产物作为PCR阳性对照样品，样品稀释液作为阴性对照样品，与待检样品cDNA同时进行套式PCR操作；取扩增产物琼脂糖凝胶电泳鉴定，当RT阳性、PCR阳性对照呈扩增阳性，RT阴性、PCR阴性对照呈扩增阴性时，判定检测反应成立；此时，若检测样品在与阳性扩增带分子量大小一致的位置出现特异性扩增条带，则判定为检测阳性，否则判定为阴性。

2.根据权利要求1设计的特异性套式PCR引物序列如下：

N127     5’-ATGTAACNCCTCTACAATGG-3’

N829     5’-GCCCTGGTTCGAACATTCT-3’

RVN371F  5’-ACAATGGAKKCTGACAARATTG-3’

RVN371R  5’-CCTGYYWGAGCCCAGTTVCCYTC-3’

3.根据权利要求1狂犬病病毒的套式RT-PCR检测方法，包括以下步骤：

A、样品总RNA的提取

用于RT-PCR检测的样品包括：脑组织样品，细胞培养RV、脑脊液及唾液样品：

(1)组织样品的预处理

以样品稀释液10×稀释研磨待检脑组织，样品采集部位以小脑、脑干及海马角为宜；

(2)液体样品的预处理

含细胞培养RV、脑脊液以及唾液；

用棉签采集的唾液样品处理时，将采样棉签倒置于离心管中，加入500μL样品稀释液4℃静置2h，4℃2000～3000r/mim离心10min，取200μL上清，置1.5mL离心管中，待检；

其他液体样品不需预处理，取100μL直接检测；

B、提取总RNA

于1mL总RNA提取液中加入待检样品100μL，室温作用5min后，加入100μL萃取剂，剧烈震荡60s后，室温条件下12000r/min离心10min；取水相上清，加入600μL RNA沉淀液，混匀后4℃静置10min，10000r/min离心10min；弃上清后加入200μL RNA洗液，10000r/min离心5min后弃上清并于室温晾干后加入20μL反转录预混体系；

进行上述反应的同时，以狂犬病病毒ERA株的细胞培养物100μL作为RT阳性对照样品，未接毒细胞培养物作为阴性对照样品，与待检样品同时进行总RNA的提取操作，并做明确标记；

C、RT反应获得cDNA

提取的总RNA沉淀中加入RT预混体系；经42℃水浴90min，95℃5min灭活反转录酶；所获得的cDNA存于-20℃待PCR；

D、套式PCR获得特异性扩增产物

取2μL RT产物，加入48μL外套PCR预混体系；同样条件下，以2μL外套产物为模板，加入48μL内套预混PCR体系；

将狂犬病毒SRV9细胞毒的总RNA的反转录产物作为PCR阳性对照样品，样品稀释液作为阴性对照样品，与待检样品cDNA同时进行套式PCR操作，并做明确标记；

外、内套PCR均按相同的循环程序进行：预变性94℃2min，然后94℃30s，56℃30s，72℃40s，35个循环，最后72℃延伸10min；取5μL扩增产物，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，紫外灯下观察扩增结果；

当RT阳性、PCR阳性对照呈扩增阳性，RT阴性、PCR阴性对照呈扩增阴性时，判定检测反应成立；此时，若检测样品在与阳性扩增带分子量大小一致的位置出现特异性扩增条带，则判定为检测阳性，否则判定为阴性。

4.根据权利要求1的方法制备的RV检测试剂盒，由总RNA提取板块、RT板块和PCR板块三个部分组成，包括总RNA提取试剂、RNA洗液，反转录预混体系、外套PCR预混体系、内套PCR预混体系以及RT反应对照样品和PCR对照样品。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：包括以下三个部分，以下数据为单次反应所需试剂：

(1)总RNA提取板块

总RNA提取液：异硫氰酸胍RNA提取液1mL；

萃取剂：氯仿200μL；

RNA洗液：70％DEPC-乙醇200μL；

RNA沉淀液：异丙醇600μL；

RT阳性对照：灭活的ERA株细胞培养物100μL；

RT阴性对照：Vero细胞培养物；

组织样品研磨液：pH7.2-7.4的0.01mol/L PBS 90μL；

(2)RT板块

RT预混体系：DEPC-H₂O 10.0μL，2.5mmol/L dNTPs 4.0μL，50pmol/μL的Random Primer 1.5μL，50pmol/μL的Oligo dT 0.5μL，10×M-MuLV buffer 2.0μL，200U/μL的M-MuLV反转录酶1.0μL，40U/μL的RNasin 1.0μL；

(3)PCR板块

外套PCR预混体系：10×Taq Buffer 5.0μL，20pmol/μL的引物N127 1.0μL，20pmol/μL的引物N829 1.0μL，10mmol/L的dNTPs 1.0μL，5U/μL的Ex-Taq 0.3μL，ddH₂O 39.7μL；

内套PCR预混体系：10×Taq Buffer 5.0μL，20pmol/μL的引物RVN371F 1.0μL，20pmol/μL的引物RVN371R 1.0μL，10mmol/L的dNTPs 1.0μL，5U/μL的Ex-Taq 0.3μL，ddH₂O 39.7μL；

PCR阳性对照：狂犬病毒SRV9株cDNA 1μL；

PCR阴性对照：pH7.2-7.4的0.01mol/L PBS 1μL。